В естественных условиях модель мыши для активации Т-клеток CD4 наивно мера, пролиферации и дифференцирования Th1, индуцированных дендритные клетки костного мозга, полученных
Summary
Здесь мы представляем протокол для определения в vivo наивно CD4 T клеток (Т-клеток) активации, пролиферации и дифференцирования Th1, вызванных костного ГМ-КСФ (BM)-дендритные клетки (DCs). Кроме того этот протокол описывает BM и T-cell изоляции, поколения DC и DC и T-cell приемных передачи.
Abstract
Количественная оценка активации клеток CD4 T наивными, пролиферации и дифференцировки Т-хелперами 1 (Th1) клетки является полезным способом оценить роль, которую играет Т-клеток в иммунной реакции. Этот протокол описывает в vitro дифференциация предшественники костного мозга (БМ) для получения гранулоцитов, макрофагов, колониестимулирующий фактор (ГМ-КСФ) производные дендритные клетки (DCs). Протокол также описывает приемных передачи овальбумина пептида (OVAp)-загружен ГМ-КСФ производные DCs и наивно CD4 Т-клеток от OTII трансгенных мышей с целью проанализировать в естественных условиях активации, пролиферации и дифференцирования Th1 из переданные CD4 Т-клеток. Этот протокол позволяет обойти ограничения методов исключительно в естественных условиях введенных неспособность специально манипулировать или выбрать популяции клеток изучены. Кроме того этот протокол позволяет исследования в среде в естественных условиях , таким образом избегая изменения функциональных факторов, которые могут произойти в пробирке и в том числе влияние типов клеток и других факторов, можно найти только в неприкосновенности органов. Протокол является полезным инструментом для создания изменений в DCs и Т-клеток, изменить адаптивного иммунного ответа, предоставляя потенциально важные результаты для понимания происхождения или развитие многочисленных сопутствующих заболеваний иммунной.
Introduction
CD4 Т-клеток и антиген представляющих клеток (БТР), таких как контроллеры домена, требуется посредников иммунитета к патогенных микроорганизмов в1,2. В периферических лимфоидных органов CD4 Т-клеток активируются после признания специфических антигенов, представленный БТР3,4,5. Активированные клетки CD4 T размножаться и дифференцироваться в отдельных конкретных эффекторных клеток Th, которые необходимы для разработки правильной адаптивного иммунного ответа6,7. Контроль этих процессов имеет решающее значение для производства адекватной адаптивной обороны, который убивает возбудителя не производит вредных тканей повреждения8. Й клетки определяются согласно выражение или производства поверхности молекул, факторов транскрипции и эффекторных цитокинов и выполняют функции основных и точные в ответ на патогены1. Клетки подмножества ячеек Th1 Экспресс транскрипционный фактор T-Бет и цитокинов интерферона гамма (IFNγ) и участие в принимающей обороны против внутриклеточных возбудителей1. Количественное определение активации клеток CD4 T наивными, пролиферации и дифференцирования Th1 является полезным средством оценки роли T клетки играют в иммунного ответа.
Этот протокол позволяет в vivo анализ способности in vitro –генерируется BM-производные DCs для модуляции активации, пролиферации и дифференцирования Th1 наивно CD4 Т-клеток. Протокол также служит, чтобы оценить способность клеток CD4 T наивно быть активирована, индуцированной размножаться, и Th1 дифференцированной (рис. 1). Этот универсальный протокол обходит неспособность специально манипулировать или выбрать исследованных клеток населения в чисто в vivo протоколы. Эффекты различных молекул и лечения на контроллерах домена могут быть изучены с помощью BM от генетически измененных мышей5 или лечения или генетически манипулировать изолированных BM клетки9. Аналогичным образом Т-клеток ответов могут быть изучены путем получения Т-клетки для приемных передачи из различных источников или после нескольких манипуляций3,8,10.
Основные преимущества этого протокола являются двоякими. Активация т-клеток, пролиферации и дифференцирования Th1 анализируются с подходом цитометрия потоков; и это в сочетании с в vivo исследований, таким образом предотвращение изменения, которые могут произойти в пробирке и включая типы клеток и другие факторы, которые можно найти только в неприкосновенности органов11.
Жизненно красители используются широко используемый метод для отслеживания пролиферации клеток, избегая использования радиоактивности. Измерения распространения с этих реагентов на основе красителя разбавления после деления клеток. Кроме того эти красители могут быть обнаружены на нескольких длинах волн и легко анализируются проточной цитометрии в сочетании с несколькими флуоресцентные антитела или маркеров. Мы подчеркнуть полезность настоящего Протокола, показывая, как активация Т-клеток, пролиферации и дифференцирования Th1 могут быть проанализированы по проточной цитометрии.
Protocol
Representative Results
Discussion
Этот протокол позволяет для характеристики BM-производные DCs способность модулировать активации, пролиферации и дифференцировки клеток CD4 T наивно. Кроме того она может также использоваться для оценки подверженности модуляции CD4 Т-клеток, БМ производные DCs. Этот протокол изменения в эти?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы благодарим д-р Симон Bartlett для английского редактирования. Это исследование было поддержано грантов из Instituto de Salud Карлоса III (ISCIII) (ПЭ14/00526; PI17/01395; ПЦ11/00145; CPII16/00022), Мигель Сервет программа и Фонд Ramón Аресес; При совместном финансировании региональных Europeo Fondo de Desarrollo (ФЕДЕР). CNIC поддерживается Министерством экономики, промышленности и конкурентоспособности (МЭПТ) и Фондом Pro CNIC и является Северо Очоа центр повышения квалификации (SEV-2015-0505). RTF основан Фонд Рамона Аресес и CNIC, VZG, ISCIII, BHF Институто де инвестигасьон обеспечиваются больница 12 де октубре (imas12) и JMG-G ISCIII Мигель Сервет программы и imas12.
Materials
| Ethanol | VWR Chemicals | 20,824,365 | 5 L |
| Scissors | Fine Science Tools (F.S.T.) | 14001-12 | |
| Forceps | Fine Science Tools (F.S.T.) | 11000-13 | |
| Fine Forceps | Fine Science Tools (F.S.T.) | 11253-20 | |
| Scalpel | Fine Science Tools (F.S.T.) | 10020-00 | Box of 100 blades |
| Fetal Bovine Serum | SIGMA | F7524 | |
| Penicillin/streptomycin | LONZA | DE17-602E | |
| Roswell Park Memorial Institute medium (RPMI) | GIBCO | 21875-034 | |
| Sterile Petri dishes | Falcon | 353003 | |
| 25-gauge needle | BD Microlance 3 | 300600 | |
| 1 ml syringe | Novico | N15663 | |
| 15 ml conical tubes | Falcon | 352096 | |
| 50 ml conical tubes | Falcon | 352098 | |
| 70 μm nylon web filter | BD Falcon | 352350 | |
| Red blood lysis buffer | SIGMA | R7757 | 100 Ml |
| EDTA | SIGMA | ED2SS-250 | |
| Bovine Serum Albumin | SIGMA | A7906 | 100 g |
| Trypan blue | SIGMA | 302643-25G | |
| Culture-plates | Falcon | 353003 | |
| 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES) | Cambrex | BE17-737E | |
| Beta-mercaptoethanol | Merck | 8-05740-0250 | |
| Sodium pyruvate | LONZA | BE13-115E | |
| L-glutamine | LONZA | BE17-605E | |
| Recombinant murine Granulocyte Macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF) | Prepotech | 315-03 | |
| lipopolysaccharide (LPS) | SIGMA-ALDRICH | L2018 | |
| 96-well-plate | Costar | 3799 | |
| v450 anti-mouse CD11b antibody | BD Biosciences | 560455 | |
| PE anti-mouse CD64 antibody | BioLegend | 139303 | |
| PE anti-mouse CD115 antibody | BioLegend | 135505 | |
| FITC anti-mouse CD11c antibody | BioLegend | 117305 | |
| FITC anti-mouse MHCII antibody | BioLegend | 125507 | |
| APC anti-mouse CD86 antibody | BioLegend | 105011 | |
| APC anti-mouse CD80 antibody | BioLegend | 104713 | |
| Flow Cytometry tubes | Zelian | 300800-1 | PS 12X75 5mL |
| OTII Ovoalbumine peptide | InvivoGen | 323-339 | |
| anti-mouse biotinylated CD8α antibody | Tonbo Biosciences | 30-0081-U500 | |
| anti-mouse biotinylated IgM antibody | BioLegend | 406503 | |
| anti-mouse biotinylated B220 antibody | Tonbo Biosciences | 30-0452-U500 | |
| anti-mouse biotinylated CD19 antibody | Tonbo Biosciences | 30-0193-U500 | |
| anti-mouse biotinylated MHCII (I-Ab) antibody | BioLegend | 115302 | |
| anti-mouse biotinylated CD11b antibody | Tonbo Biosciences | 30-0112-U500 | |
| anti-mouse biotinylated CD11c antibody | BioLegend | 117303 | |
| anti-mouse biotinylated CD44 antibody | BioLegend | 103003 | |
| anti-mouse biotinylated CD25 antibody | Tonbo Biosciences | 30-0251-U100 | |
| anti-mouse biotinylated DX5 antibody | BioLegend | 108903 | |
| streptavidin-coated magnetic microbeads | MACS Miltenyi Biotec | 130-048-101 | |
| Magnetic cell separator | MACS Miltenyi Biotec | 130-090-976 | QuadroMACS Separator |
| Separation columns | MACS Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| PE anti-mouse CD4 antibody | BioLegend | 100408 | |
| APC anti-mouse CD3 antibody | BioLegend | 100235 | |
| FITC anti-mouse CD8 antibody | Tonbo Biosciences | 35-0081-U025 | |
| Cell Violet Tracer | Thermofisher | C34557 | |
| APC anti-mouse CD25 antibody | Tonbo Biosciences | 20-0251-U100 | |
| Alexa647 anti-mouse CD69 antibody | BioLegend | 104518 | |
| PerCPCY5.5 anti-mouse CD45.1 antibody | Tonbo Biosciences | 65-0453 | |
| APC anti-mouse CD45.1 antibody | Tonbo Biosciences | 20-0453 | |
| PECY7 anti-mouse CD45.1 antibody | Tonbo Biosciences | 60-0453 | |
| FITC anti-mouse CD45.2 antibody | Tonbo Biosciences | 35-0454 | |
| Ionomycin | SIGMA-ALDRICH | I0634 | |
| Phorbol 12 Myristate 13 Acetate (PMA) | SIGMA | P8139 | |
| Brefeldin A (BD GolgiPlug) | BD | 555029 | |
| Paraformaldehyde | Millipore | 8-18715-02100 | |
| Intracellular permeabilization buffer | eBioscience | 00-8333 | |
| APC anti-mouse IFNg antibody | Tonbo Biosciences | 20-7311-U100 | |
| Fc-block (anti-mouse CD16/CD32) | Tonbo Biosciences | 70-0161-U100 | |
| B6.SJL CD45.1 mice | The Jackson Laboratory | 002014 | |
| BD LSRFortessa™ Cell Analyzer | BD Biosciences | 649225 | |
| DAPI Solution | Thermofisher | 62248 |
Riferimenti
- Zhu, J., Yamane, H., Paul, W. E. Differentiation of effector CD4 T cell populations (*). Annual Review of Immunology. 28, 445-489 (2010).
- Bustos-Moran, E., Blas-Rus, N., Martin-Cofreces, N. B., Sanchez-Madrid, F. Orchestrating Lymphocyte Polarity in Cognate Immune Cell-Cell Interactions. International Review of Cell and Molecular Biology. 327, 195-261 (2016).
- Gonzalez-Granado, J. M., et al. Nuclear envelope lamin-A couples actin dynamics with immunological synapse architecture and T cell activation. Science Signaling. 7 (322), ra37 (2014).
- Rocha-Perugini, V., Gonzalez-Granado, J. M. Nuclear envelope lamin-A as a coordinator of T cell activation. Nucleus. 5 (5), 396-401 (2014).
- Rocha-Perugini, V., et al. CD9 Regulates Major Histocompatibility Complex Class II Trafficking in Monocyte-Derived Dendritic Cells. Molecular and Cellular Biology. 37 (15), (2017).
- Kaech, S. M., Wherry, E. J., Ahmed, R. Effector and memory T-cell differentiation: implications for vaccine development. Nature Reviews Immunology. 2 (4), 251-262 (2002).
- Iborra, S., Gonzalez-Granado, J. M. In Vitro Differentiation of Naive CD4(+) T Cells: A Tool for Understanding the Development of Atherosclerosis. Methods in Molecular Biology. 1339, 177-189 (2015).
- Toribio-Fernandez, R., et al. Lamin A/C augments Th1 differentiation and response against vaccinia virus and Leishmania major. Cell Death & Disease. 9 (1), 9 (2018).
- Lee, T., Shevchenko, I., Sprouse, M. L., Bettini, M., Bettini, M. L. Retroviral Transduction of Bone Marrow Progenitor Cells to Generate T-cell Receptor Retrogenic Mice. Journal of Visualized Experiments. (113), (2016).
- Cruz-Adalia, A., et al. Conventional CD4(+) T cells present bacterial antigens to induce cytotoxic and memory CD8(+) T cell responses. Nature Communications. 8 (1), 1591 (2017).
- Quah, B. J., Wijesundara, D. K., Ranasinghe, C., Parish, C. R. The use of fluorescent target arrays for assessment of T cell responses in vivo. Journal of Visualized Experiments. (88), e51627 (2014).
- Cruz-Adalia, A., Ramirez-Santiago, G., Torres-Torresano, M., Garcia-Ferreras, R., Veiga Chacon, E. T Cells Capture Bacteria by Transinfection from Dendritic Cells. Journal of Visualized Experiments. (107), e52976 (2016).
- Cossarizza, A., et al. Guidelines for the use of flow cytometry and cell sorting in immunological studies. European Journal of Immunology. 47 (10), 1584-1797 (2017).
- Quah, B. J., Parish, C. R. New and improved methods for measuring lymphocyte proliferation in vitro and in vivo using CFSE-like fluorescent dyes. Journal of Immunological Methods. 379 (1-2), 1-14 (2012).
- Yardeni, T., Eckhaus, M., Morris, H. D., Huizing, M., Hoogstraten-Miller, S. Retro-orbital injections in mice. Lab Animals (NY). 40 (5), 155-160 (2011).
- Warth, S. C., Heissmeyer, V. Adenoviral transduction of naive CD4 T cells to study Treg differentiation. Journal of Visualized Experiments. (78), (2013).
- Liou, H. L., Myers, J. T., Barkauskas, D. S., Huang, A. Y. Intravital imaging of the mouse popliteal lymph node. Journal of Visualized Experiments. (60), (2012).
