نموذج ماوس في فيفو إلى تدبير السذاجة CD4 تي خلية التنشيط وانتشارها والتمايز Th1 الناجمة عن الخلايا الجذعية المشتقة من نخاع العظام
Summary
نقدم هنا، على بروتوكول لتحديد في فيفو السذاجة CD4 T الخلية (خلية T) تنشيط وانتشار، والتمايز Th1 الناجمة عن نخاع العظام GM-CSF (بي أم)-اشتقاق الخلايا الجذعية (DCs). وبالإضافة إلى ذلك، يصف هذا البروتوكول العزلة BM وخلايا T، وجيل العاصمة ونقل العاصمة وخلايا T التبني.
Abstract
التحديد الكمي لتنشيط خلية CD4 T ساذجة والانتشار والتمايز إلى مساعد تي 1 (Th1) الخلايا طريقة مفيدة لتقييم الدور الذي تلعبه الخلايا T في استجابة مناعية. ويصف هذا البروتوكول في المختبر التفريق بين فروعه نخاع العظم (بي أم) للحصول على المحببات بلعم التي حفز مستعمرة الخلايا الجذعية المشتقة عامل (GM-CSF) (DCs). كما يصف البروتوكول نقل التبني ovalbumin الببتيد (أوفاب)-تحميل DCs مشتقة من GM-CSF وخلايا CD4 T ساذجة من الفئران المعدلة وراثيا أوتيي من أجل تحليل التنشيط في فيفو ، والانتشار، والتمايز Th1 من نقل خلايا CD4 تي. هذا البروتوكول تلتف الحد من محض في فيفو أساليب فرضها عدم القدرة على التحديد التلاعب أو حدد الخلية درس السكان. وعلاوة على ذلك، يتيح هذا البروتوكول دراسات في فيفو بيئة، وبالتالي تجنب التعديلات الفنية من العوامل التي قد تحدث في المختبر وذلك إلى تأثير أنواع الخلايا وعوامل أخرى لا توجد إلا في أجهزة سليمة. البروتوكول أداة مفيدة لتوليد التغييرات في وحدات تحكم المجال Dc وخلايا تي أن تعديل الاستجابات المناعية التكيفية، يحتمل أن تقدم نتائج هامة لفهم منشأ أو تطوير محصنة ضد العديد من الأمراض المرتبطة بها.
Introduction
خلايا CD4 T ومستضد تقديم الخلايا (Apc) مثل وحدات تحكم المجال Dc بالوسطاء مطلوب من الحصانة لمسببات الأمراض الميكروبية1،2. في الأجهزة الطرفية اللمفاوية، يتم تنشيط خلايا CD4 T عند الاعتراف بمولدات المضادات المحددة المقدمة من ناقلات الجنود المدرعة3،،من45. تنشيط خلايا CD4 تي تتكاثر وتفرق في خلايا Th المستجيب محددة مميزة ضرورية لتطوير الاستجابة المناعية التكيفية الصحيح6،7. السيطرة على هذه العمليات أمر بالغ الأهمية لإنتاج دفاع كافية تكيفية التي تقتل مسببات المرض دون إنتاج الأنسجة الضارة الضرر8. خلايا Th تتحدد وفقا لتعبير أو إنتاج الجزيئات السطحية، وعوامل النسخ والمستجيب السيتوكينات، وأداء مهام أساسية ومحددة استجابة للعوامل الممرضة1. خلايا فرعية خلية Th1 التعبير عامل النسخ تي-الرهان و γ انترفيرون سيتوكين (IFNγ)، والمشاركة في المضيف في الدفاع ضد الجراثيم داخل الخلايا1. التحديد الكمي لتنشيط خلية CD4 T ساذجة وانتشارها، والتمايز Th1 وسيلة مفيدة لتقييم الخلايا T الدور الذي تضطلع به في استجابة مناعية.
هذا التحليل فيفو في تمكين البروتوكول من القدرة في المختبر-ولدت المستمدة من BM DCs تعدل التنشيط، وانتشار، والتمايز Th1 خلايا CD4 T ساذجة. البروتوكول يعمل أيضا لتقييم قدرة خلايا CD4 T السذاجة المنشط، والتي يسببها آخذة في الانتشار، و Th1 متباينة (الشكل 1). هذا البروتوكول تنوعاً تلتف التمكن على وجه التحديد التلاعب أو حدد الخلية درس السكان في صرفة في فيفو البروتوكولات. يمكن دراسة آثار الجزيئات المتنوعة والعلاجات على وحدات تحكم المجال Dc باستخدام BM من الفئران المعدلة وراثيا5 أو علاج أو التلاعب وراثيا الخلايا BM معزولة9. وبالمثل، يمكن استكشاف ردود الخلية T بالحصول على خلايا T لنقل التبني من مصادر مختلفة أو بعد عدة التلاعب3،،من810.
المزايا الرئيسية لهذا البروتوكول ذات شقين. ويتم تحليل تنشيط خلية تي وانتشارها، والتمايز Th1 بنهج تدفق الخلوي؛ وهذا هو جنبا إلى جنب مع فيفو الدراسات، مما يمنع حدوث التغيرات التي قد تحدث في المختبر ، بما في ذلك أنواع الخلايا وعوامل أخرى لا توجد إلا في أجهزة سليمة11.
استخدام الأصباغ الحيوية تقنية تستخدم على نطاق واسع لتتبع انتشار الخلايا مع تجنب استعمال النشاط الإشعاعي. ويستند قياس الانتشار مع هذه الكواشف تمييع صبغ بعد انقسام الخلية. وعلاوة على ذلك، هذه الأصباغ يمكن الكشف عنها عند أطوال موجية متعددة ويتم تحليلها بسهولة بالتدفق الخلوي في تركيبة مع عدة علامات أو أجسام مضيئة. نسلط الضوء على فائدة هذا البروتوكول من خلال إظهار كيف يمكن تحليل تنشيط خلية تي وانتشارها، والتمايز Th1 بالتدفق الخلوي.
Protocol
Representative Results
Discussion
يسمح هذا البروتوكول لوصف قدرة المستمدة من BM DCs تعدل التنشيط وانتشارها، والتفريق بين خلايا CD4 T ساذجة. وعلاوة على ذلك، يمكن أيضا استخدامه لتقييم قابلية خلايا CD4 T للتحوير بوحدات تحكم المجال Dc المستمدة من بي أم. مع أحكام هذا البروتوكول، التغييرات في هذه الأحداث يمكن أن يقاس في فيفو.
<p class…Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ونحن نشكر الدكتور سيمون بارتليت لتحرير اللغة الإنجليزية. كان يؤيد هذه الدراسة من المنح المقدمة من معهد دي السعود كارلوس الثالث (إيسسيي) (PI14/00526؛ PI17/01395؛ CP11/00145؛ CPII16/00022)، ميغيل سيرفيت البرنامج ومؤسسة رامون أريسيس؛ بتمويل مشترك من فوندو Europeo للتنمية الإقليمية (فدر). المحوسبة بطاقة الهوية الوطني معتمد من قبل وزارة الاقتصاد والصناعة و “القدرة التنافسية” (ميتش) ومؤسسة برو المحوسبة بطاقة الهوية الوطني وسيفيرو أوتشوا مركز التميز (SEV-2015-0505). RTF هو تأسست على يد مؤسسة رامون أريسيس والمحوسبة بطاقة الهوية الوطني، فزج من إيسسيي، بهف بمعهد دي JMG-ز البرنامج سيرفيت ميغيل إيسسيي و imas12 وبحوث سانيتاريا مستشفى 12 دي تشرين الأول/أكتوبر (imas12).
Materials
| Ethanol | VWR Chemicals | 20,824,365 | 5 L |
| Scissors | Fine Science Tools (F.S.T.) | 14001-12 | |
| Forceps | Fine Science Tools (F.S.T.) | 11000-13 | |
| Fine Forceps | Fine Science Tools (F.S.T.) | 11253-20 | |
| Scalpel | Fine Science Tools (F.S.T.) | 10020-00 | Box of 100 blades |
| Fetal Bovine Serum | SIGMA | F7524 | |
| Penicillin/streptomycin | LONZA | DE17-602E | |
| Roswell Park Memorial Institute medium (RPMI) | GIBCO | 21875-034 | |
| Sterile Petri dishes | Falcon | 353003 | |
| 25-gauge needle | BD Microlance 3 | 300600 | |
| 1 ml syringe | Novico | N15663 | |
| 15 ml conical tubes | Falcon | 352096 | |
| 50 ml conical tubes | Falcon | 352098 | |
| 70 μm nylon web filter | BD Falcon | 352350 | |
| Red blood lysis buffer | SIGMA | R7757 | 100 Ml |
| EDTA | SIGMA | ED2SS-250 | |
| Bovine Serum Albumin | SIGMA | A7906 | 100 g |
| Trypan blue | SIGMA | 302643-25G | |
| Culture-plates | Falcon | 353003 | |
| 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES) | Cambrex | BE17-737E | |
| Beta-mercaptoethanol | Merck | 8-05740-0250 | |
| Sodium pyruvate | LONZA | BE13-115E | |
| L-glutamine | LONZA | BE17-605E | |
| Recombinant murine Granulocyte Macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF) | Prepotech | 315-03 | |
| lipopolysaccharide (LPS) | SIGMA-ALDRICH | L2018 | |
| 96-well-plate | Costar | 3799 | |
| v450 anti-mouse CD11b antibody | BD Biosciences | 560455 | |
| PE anti-mouse CD64 antibody | BioLegend | 139303 | |
| PE anti-mouse CD115 antibody | BioLegend | 135505 | |
| FITC anti-mouse CD11c antibody | BioLegend | 117305 | |
| FITC anti-mouse MHCII antibody | BioLegend | 125507 | |
| APC anti-mouse CD86 antibody | BioLegend | 105011 | |
| APC anti-mouse CD80 antibody | BioLegend | 104713 | |
| Flow Cytometry tubes | Zelian | 300800-1 | PS 12X75 5mL |
| OTII Ovoalbumine peptide | InvivoGen | 323-339 | |
| anti-mouse biotinylated CD8α antibody | Tonbo Biosciences | 30-0081-U500 | |
| anti-mouse biotinylated IgM antibody | BioLegend | 406503 | |
| anti-mouse biotinylated B220 antibody | Tonbo Biosciences | 30-0452-U500 | |
| anti-mouse biotinylated CD19 antibody | Tonbo Biosciences | 30-0193-U500 | |
| anti-mouse biotinylated MHCII (I-Ab) antibody | BioLegend | 115302 | |
| anti-mouse biotinylated CD11b antibody | Tonbo Biosciences | 30-0112-U500 | |
| anti-mouse biotinylated CD11c antibody | BioLegend | 117303 | |
| anti-mouse biotinylated CD44 antibody | BioLegend | 103003 | |
| anti-mouse biotinylated CD25 antibody | Tonbo Biosciences | 30-0251-U100 | |
| anti-mouse biotinylated DX5 antibody | BioLegend | 108903 | |
| streptavidin-coated magnetic microbeads | MACS Miltenyi Biotec | 130-048-101 | |
| Magnetic cell separator | MACS Miltenyi Biotec | 130-090-976 | QuadroMACS Separator |
| Separation columns | MACS Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| PE anti-mouse CD4 antibody | BioLegend | 100408 | |
| APC anti-mouse CD3 antibody | BioLegend | 100235 | |
| FITC anti-mouse CD8 antibody | Tonbo Biosciences | 35-0081-U025 | |
| Cell Violet Tracer | Thermofisher | C34557 | |
| APC anti-mouse CD25 antibody | Tonbo Biosciences | 20-0251-U100 | |
| Alexa647 anti-mouse CD69 antibody | BioLegend | 104518 | |
| PerCPCY5.5 anti-mouse CD45.1 antibody | Tonbo Biosciences | 65-0453 | |
| APC anti-mouse CD45.1 antibody | Tonbo Biosciences | 20-0453 | |
| PECY7 anti-mouse CD45.1 antibody | Tonbo Biosciences | 60-0453 | |
| FITC anti-mouse CD45.2 antibody | Tonbo Biosciences | 35-0454 | |
| Ionomycin | SIGMA-ALDRICH | I0634 | |
| Phorbol 12 Myristate 13 Acetate (PMA) | SIGMA | P8139 | |
| Brefeldin A (BD GolgiPlug) | BD | 555029 | |
| Paraformaldehyde | Millipore | 8-18715-02100 | |
| Intracellular permeabilization buffer | eBioscience | 00-8333 | |
| APC anti-mouse IFNg antibody | Tonbo Biosciences | 20-7311-U100 | |
| Fc-block (anti-mouse CD16/CD32) | Tonbo Biosciences | 70-0161-U100 | |
| B6.SJL CD45.1 mice | The Jackson Laboratory | 002014 | |
| BD LSRFortessa™ Cell Analyzer | BD Biosciences | 649225 | |
| DAPI Solution | Thermofisher | 62248 |
Riferimenti
- Zhu, J., Yamane, H., Paul, W. E. Differentiation of effector CD4 T cell populations (*). Annual Review of Immunology. 28, 445-489 (2010).
- Bustos-Moran, E., Blas-Rus, N., Martin-Cofreces, N. B., Sanchez-Madrid, F. Orchestrating Lymphocyte Polarity in Cognate Immune Cell-Cell Interactions. International Review of Cell and Molecular Biology. 327, 195-261 (2016).
- Gonzalez-Granado, J. M., et al. Nuclear envelope lamin-A couples actin dynamics with immunological synapse architecture and T cell activation. Science Signaling. 7 (322), ra37 (2014).
- Rocha-Perugini, V., Gonzalez-Granado, J. M. Nuclear envelope lamin-A as a coordinator of T cell activation. Nucleus. 5 (5), 396-401 (2014).
- Rocha-Perugini, V., et al. CD9 Regulates Major Histocompatibility Complex Class II Trafficking in Monocyte-Derived Dendritic Cells. Molecular and Cellular Biology. 37 (15), (2017).
- Kaech, S. M., Wherry, E. J., Ahmed, R. Effector and memory T-cell differentiation: implications for vaccine development. Nature Reviews Immunology. 2 (4), 251-262 (2002).
- Iborra, S., Gonzalez-Granado, J. M. In Vitro Differentiation of Naive CD4(+) T Cells: A Tool for Understanding the Development of Atherosclerosis. Methods in Molecular Biology. 1339, 177-189 (2015).
- Toribio-Fernandez, R., et al. Lamin A/C augments Th1 differentiation and response against vaccinia virus and Leishmania major. Cell Death & Disease. 9 (1), 9 (2018).
- Lee, T., Shevchenko, I., Sprouse, M. L., Bettini, M., Bettini, M. L. Retroviral Transduction of Bone Marrow Progenitor Cells to Generate T-cell Receptor Retrogenic Mice. Journal of Visualized Experiments. (113), (2016).
- Cruz-Adalia, A., et al. Conventional CD4(+) T cells present bacterial antigens to induce cytotoxic and memory CD8(+) T cell responses. Nature Communications. 8 (1), 1591 (2017).
- Quah, B. J., Wijesundara, D. K., Ranasinghe, C., Parish, C. R. The use of fluorescent target arrays for assessment of T cell responses in vivo. Journal of Visualized Experiments. (88), e51627 (2014).
- Cruz-Adalia, A., Ramirez-Santiago, G., Torres-Torresano, M., Garcia-Ferreras, R., Veiga Chacon, E. T Cells Capture Bacteria by Transinfection from Dendritic Cells. Journal of Visualized Experiments. (107), e52976 (2016).
- Cossarizza, A., et al. Guidelines for the use of flow cytometry and cell sorting in immunological studies. European Journal of Immunology. 47 (10), 1584-1797 (2017).
- Quah, B. J., Parish, C. R. New and improved methods for measuring lymphocyte proliferation in vitro and in vivo using CFSE-like fluorescent dyes. Journal of Immunological Methods. 379 (1-2), 1-14 (2012).
- Yardeni, T., Eckhaus, M., Morris, H. D., Huizing, M., Hoogstraten-Miller, S. Retro-orbital injections in mice. Lab Animals (NY). 40 (5), 155-160 (2011).
- Warth, S. C., Heissmeyer, V. Adenoviral transduction of naive CD4 T cells to study Treg differentiation. Journal of Visualized Experiments. (78), (2013).
- Liou, H. L., Myers, J. T., Barkauskas, D. S., Huang, A. Y. Intravital imaging of the mouse popliteal lymph node. Journal of Visualized Experiments. (60), (2012).
