유전자 변형, 짧은 목표, 및 교 잡 시험 현장에서 RNA와 형태학 상 조직 맥락에서 점 돌연변이 시각화
Summary
여기, 우리는 현장에서 교 잡 분석 결과 시퀀스를 단일 세포 수준에서 단일 뉴클레오티드 해상도 50 뉴클레오티드의 짧은의 과민 하 고 특정 검색을 가능 하 게 설명 합니다. 수동으로 또는 자동으로 수행할 수 있습니다, 분석 결과, 결합 이체, 짧은 시퀀스, 그리고 조직 컨텍스트 내에서 돌연변이의 시각화를 설정할 수 있습니다.
Abstract
정밀 의학 생체의 정확한 탐지에 매우 의존 때문에, RNA 생체에서 현장에서 임상 표본에서 측정 표준화 하 고 강력한 기술 위한 증가 필요가 있다. 갈기 바인딩 분석 RNAseq 같은 양적 RT-PCR 가능 하 게 매우 민감한 유전자 표현 하는 동안 그들은 또한 RNA 추출 필요 하 고 따라서 형태학 조직 컨텍스트 내에서 귀중 한 식 분석을 방지 합니다. 현장에서 교 잡 (ISH) 분석 결과 여기에 설명 된 짧은 단일 뉴클레오티드 해상도 단일 세포 수준에서 50 뉴클레오티드 RNA 대상 시퀀스를 검색할 수 있습니다. 이 분석 결과 이전 개발된 상업 분석 결과를 보완 하 고 스플라이스 변종, 짧은 목표와 조직 내의 점 돌연변이의 과민 하 고 특정 위치에서 검색을 수 있습니다. 이 프로토콜에서 프로브 2 개의 임상으로 중요 한 결합 이체, EGFRvIII 및 METΔ14에 대 한 독특한 exon 접합을 대상으로 설계 되었다. 짧은 대상 시퀀스의 탐지는 T 세포 수용 체 α와 β Jurkat T-셀 라인의 CDR3 시퀀스의 특정 감지에 의해 시연 했다. 자동화 된 얼룩을 사용 하 여 셀 라인에서 EGFR L858R와 KRA G12A 단일 염기 변이의 시각화를 통해 단일 뉴클레오티드 해상도 (점 돌연변이) RNA 대상 시퀀스의 구별에 대 일 분 분석 결과의 유틸리티는 또한 표시 플랫폼입니다. 요약 하자면, 프로토콜 결합 이체, 짧은 시퀀스, 그리고 돌연변이 제자리에 수동 성능에 대 한 자동화 된 stainers에의 탐지를 가능 하 게 전문화 된 RNA 분 분석 결과를 보여줍니다.
Introduction
Microarrays, 다음-gen RNA 시퀀싱 (RNAseq) 등 높은 처리량 transcriptomic 기술 등 다양 한 질병에 대 한 진단, 예 후, 그리고 예측 임상 가치와 RNA 마커의 발견 향상 기 하 급수적으로 암1,2. 이러한 바이오 마커의 정밀 의학에서의 사용을, 높은 있다 RNA 생체 조직의 컨텍스트 내에서 임상 샘플을 측정할 수 있는 표준화 된 하 고 강력한 기술에 대 한 필요. 널리 설립 RNAseq 등 양적 RT-PCR 분석 실험 갈기 바인딩 가능 하 게 매우 민감한 유전자 표현, 하는 동안 필요한 조직 균질 및 RNA 격리 의미 vivo에서 세포 형 특이성의 손실 및 형태학 정보3. 기존의 현장에서 RNA 검출 방법론 부족 감도 특이성 희귀 또는 낮은 표현 RNA 생체 조직 컨텍스트4내에서 안정적으로 측정 하는 데 필요한.
상업 현장에서 교 잡 (ISH) 분석 결과 (예., RNAscope 분석 결과)은 이러한 태 클은 한 기술 도전과 300 보다 큰 단일 RNA 분자의 높게 과민 하 고 특정 시각화를 해줍니다 컨텍스트 내에서 조직 형태학의 뉴클레오티드 이러한 유형의 분석 결과 약 6-20 더블 Z 프로브 쌍 함께 고급 하이브리드 기반 신호 증폭5의 독특한 oligonucleotide 조사 디자인을 사용 합니다.
이 연구는 특수 RNA 분 분석 결과를, BaseScope, 짧은 단일 뉴클레오티드 해상도 50 뉴클레오티드 RNA 대상 시퀀스를 검색할 수 있는 이전에 디자인 상업 기술 보완에 대해 설명 합니다. 이 분석 결과 transcriptome의 복잡 한 복잡성을 해결 하 고 exon 접합, 짧은 대상 시퀀스, 그리고 조금 한 더블 Z 프로브 쌍을 사용 하 여 조직 컨텍스트 (표 1)에서 점 돌연변이의 정확한 탐지를 위해 적용 가능 하다. 이 보고서는 완전 한 분석 결과 프로토콜과 결합 이체, T 세포 수용 체 클론 CDR3 시퀀스의 검출에 사용 및 고 FFPE에 단일 염기 돌연변이 세포 선 및 종양 조직.
Protocol
이 연구에 사용 된 인간의 종양 샘플 deidentified 되었고 인간의 연구에 대 한 로컬 윤리 지침에 따라 상용 소스 로부터 획득. 1. 샘플, 장비 및 시 약 준비 FFPE 샘플 준비 조직 바로 다음 해 부, 조직 (두께에서 3-4 m m의 블록으로 절단) 10% 중립 버퍼링 포 르 말린 (NBF) 실 온 (RT)에서 16-32 h에 대 한 수정 했다.참고: 고정 시간 조직 유형 및 크기에 따라 달라 집니다. 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS) x 1 샘플을 세척 하 고 표준 에탄올 (EtOH) 시리즈를 사용 하 여 탈수 (70 -60 분, 80% EtOH 30-60 분, 90% EtOH 30-60 분, 95% EtOH 30-60 분, 3 x 100% EtOH EtOH 30-60 분) 뒤에 크 실 렌. 6 표준 절차 사용 하 여 파라핀에 샘플을 포함 하 고 초과 파라핀을 제거 하는 데 필요한 파라핀 블록을 잘라.참고: 블록 크기 조직 샘플 크기에 따라 다르지만 일반적인 크기는 0.75 0.75 인치2 x 또는 더 작은. 셀 라인 수집 하 고 특정 셀 라인에 대 한 권장 방법 셀을 펠 렛. 회전자에 24 h에 대 한 RT에서 10% 포름알데히드에서 셀을 수정 합니다. Prewarmed 처리 젤에서 펠 릿으로 셀 준비 (예., Histogel). 얼음, parafilm의 조각에 젤 셀 펠 릿을 배치 하 여 공고히 펠 릿을 허용 하 고 Submerge 1 x PBS에 젤 셀 펠 릿 2-3 분 동안 앉아 보자. 탈수 하 고 1.1.1 단계에서 설명한 대로 셀 펠 릿을 포함. 섹션 준비 포함 된 조직/세포는 톰을 사용 하 여 5 ± 1 μ m 섹션으로, 정전 접착제 유리 슬라이드에 섹션을 탑재 잘라내어 실시간에 그들을 하룻밤 건조참고: 슬라이드 저장할 수 있습니다 RT에 최대 3 개월 동안 건조에서. 슬라이드 슬라이드 랙에 배치 하 고 분석 결과 수행 하기 전에 순환 공기 오븐 1 h를 위한 60 ° C에 탑재 된 조직 슬라이드를 구워.참고: 슬라이드를 사용 하 여 즉시 또는 1 주일 방와 RT에 저장. 장기간된 보관 RNA 저하 될 수 있습니다. 장비 준비 40 ° c 교 잡 오븐을 설정 철저 하 게 젖은 humidifying 종이 습도 제어 쟁반으로 어떤 잔여 dH2오 삽입 종이 제거 하 고 사용 하기 전에 적어도 30 분 동안 prewarm를 교 잡 오븐 트레이 삽입. 시 약 준비 크 실 렌의 200 mL와 함께 에이전트 요리를 비운 2를 100%의 200 mL와 함께 두 개의 얼룩 요리를 채우기 EtOH 섹션의 deparaffinization를 위해 사용 될 것입니다. 10 x 대상 검색 시 약 20 mL를 dH2O의 180 mL을 추가 하 여 상용 1 x 대상 검색 시 약 200ml를 준비 합니다. 기선에 두 슬라이드 홀더를 배치 합니다. 대상 검색 시 약 x 1의 200 mL와 함께 한 슬라이드 홀더를 채워 다른 슬라이드 홀더 dH2오 열 200 mL 증기선을 사용 하 여 종 두 솔루션. 40 ° c의 60ml를 희석 하 여 1 x 워시 버퍼의 10-20 분 준비 3 L에 대 한 따뜻한 50 x 워시 버퍼 prewarmed dH2O. 2.94 l 50 x 워시 버퍼 증기 두건에서 dH2o.의 100 mL를 100 mL의 길의 되며 추가 하 여 솔루션 counterstaining 50% 길 되며 준비 증기 두건에서 dH2오의 250 mL를 28-30% 수산화 암모늄의 1.43 mL을 추가 하 여 청소법 시 약 (0.02% (w/v) 암모니아 물)를 준비 Prewarm 교 잡 조사 전에 10 분 동안 40 ° C에서 대상 프로브와 실시간 증폭 시 약 (앰프 0-6) 2. RNA 제자리에서 교 잡 시험 Deparaffinization 및 탈수 1.1.3.2 단계에서 설명한 대로 베이킹 후 (선택 사항 중지 포인트 1), 동요와 5 분 동안 크 실 렌에 섹션을 deparaffinize. 다시 5 분 Dehydrate 100%에 대 한 신선한 자일 렌에 deparaffinize 동요, 그리고 신선한 100%에서 다시 반복 2 분 EtOH EtOH 2 분. 공기 순환 공기 오븐에서 60 ° C에서 5 분에 대 한 슬라이드를 건조 또는 RT에 때까지 완전히 건조 (옵션 중지 포인트 2). 샘플 전처리 내 인 성 과산화 효소 활동을 풀기 위해 RT에서 10 분에 대 한 준비-사용 수소 과산화물의 ~ 4 방울과 섹션을 품 어. 슬라이드에서 솔루션을 가만히 따르다와 dH2오로 두 번 그들을 씻어합니다 대상 검색 시 기선에 100 ° C에서 15-30 분의 200 mL와 함께 섹션을 품 어.참고: 보육 시간 조직 유형에 따라 달라질 수 있습니다. 이 프로토콜에서 대상 검색 종양 샘플을 셀 알 약 15 분 동안 수행 되었다. 슬라이드에서 솔루션을 가만히 따르다, dH2O와 두 번 린스, 100%에서 찍어 EtOH 3 분을 슬라이드 또는 RT까지 완전히 순환 공기 오븐에서 60 ℃에서 건조에 대 한. 소수 성 펜, 약 0.75 x 0.75 인치2를 사용 하 여 섹션 주위 소수 배리어를 그립니다.참고: 그것은 작은 방 벽을 그리는 권장 하지 않습니다. 큰 섹션에 대 한 더 큰 방 벽을 그릴 수 필요 합니다. 1 분 동안 완전히 말리 던 하룻밤 RT에 배리어를 하자 (옵션 중지 지점 3). 슬라이드를 슬라이드 홀더에 놓고 습도 제어 트레이에 슬라이드 홀더를 배치 합니다. 각 슬라이드에 효소 III의 ~ 4 방울을 추가 하 고 단백질 소화에 대 한 교 잡 오븐에 40 ° C에서 15-30 분 동안 그들을 품 어.참고: 보육 시간 조직 유형에 따라 달라질 수 있습니다. 이 프로토콜에서 효소 소화는 종양 샘플에 대 일 분 및 셀 펠 릿에 대 일 분 수행 되었다. 슬라이드에서 솔루션을 가만히 따르다와 dH2오로 두 번 그들을 씻어합니다 프로브 교 잡 전체 섹션을 충당 하기 위해 적절 한 준비-사용 프로브 솔루션의 ~ 4 방울을 추가 합니다. 더 큰 섹션을 사용 하는 경우 추가 ~ 5-6 방울. 교 잡 오븐에 40 ° C에서 2 시간에 대 한 프로브 교배 슬라이드에서 솔루션을 가만히 따르다 하 고 가끔 동요와 RT에 2 분 동안 세척 버퍼 x 1의 200 mL에 슬라이드를 씻어. 이 단계에서 세척 절차를 반복 합니다. 신호 증폭 30 분 Decant 솔루션에 대 한 교 잡 오븐에 40 ° C에서 슬라이드 당 앰프 0 ~ 4 방울과 섹션을 품 어 하 고 가끔 동요와 RT에서 2 분에 대 한 1 x 워시 버퍼의 200 mL에 슬라이드를 씻어. 이 단계에서 세척 절차를 반복 합니다. 15 분 Decant 솔루션에 대 한 교 잡 오븐에 40 ° C에서 슬라이드 당 앰프 1 ~ 4 방울과 섹션을 품 어 하 고 가끔 동요와 RT에 2 분 동안 세척 버퍼 x 1의 200 mL에 슬라이드를 씻어. 세척 절차를 반복 합니다. 30 분 Decant 솔루션에 대 한 교 잡 오븐에 40 ° C에서 슬라이드 당 앰프 2 ~ 4 방울과 섹션을 품 어 하 고 가끔 동요와 RT에 2 분 동안 세척 버퍼 x 1의 200 mL에 슬라이드를 씻어. 세척 절차를 반복 합니다. 30 분 Decant 솔루션에 대 한 교 잡 오븐에 40 ° C에서 슬라이드 당 앰프 3 ~ 4 방울과 섹션을 품 어 하 고 가끔 동요와 RT에 2 분 동안 세척 버퍼 x 1의 200 mL에 슬라이드를 씻어. 세척 절차를 반복 합니다. 15 분 Decant 솔루션에 대 한 교 잡 오븐에 40 ° C에서 슬라이드 당 앰프 4 ~ 4 방울과 섹션을 품 어 하 고 가끔 동요와 RT에 2 분 동안 세척 버퍼 x 1의 200 mL에 슬라이드를 씻어. 세척 절차를 반복 합니다. 30 분 Decant 솔루션에 대 한 실시간에 슬라이드 당 앰프 5 ~ 4 방울과 섹션을 품 어 하 고 가끔 동요와 RT에 2 분 동안 세척 버퍼 x 1의 200 mL에 슬라이드를 씻어. 세척 절차를 반복 합니다. 15 분 Decant 솔루션에 대 한 실시간에 슬라이드 당 앰프 6 ~ 4 방울과 섹션을 품 어 하 고 가끔 동요와 RT에 2 분 동안 세척 버퍼 x 1의 200 mL에 슬라이드를 씻어. 세척 절차를 반복 합니다. 신호 검출 솔루션 작업 빠른 레드 염료를 준비 합니다. 0.75 x 0.75 인치2 배리어와 하나의 슬라이드에 대 한 추가 빠른 레드 B 염료의 2 μ 빠른의 120 μ 튜브와 잘 혼합에 레드-A.참고: 소수 성 장벽 및 슬라이드 수의 크기에 따라 빠른 레드 작업 솔루션의 볼륨 달라 집니다. 슬라이드에서 과잉 액체를 가만히 따르다와 슬라이드 솔루션 작업 빠른 레드 염료를 추가 합니다. 빛에 노출을 피하기 위해 커버와 함께 트레이에 RT에서 10 분에 대 한 슬라이드를 품 어.참고: 빠른 작업 준비, 5 분 이내 솔루션 레드를 사용 하 고 직접적인 햇빛 또는 UV 빛에 노출 하지 마십시오. 레드 빠른 솔루션을 가만히 따르다와 린스 수돗물으로 두 번 슬라이드. 슬라이드 슬라이드 선반에 다시 놓습니다. Counterstaining Counterstain 실시간 세척에 2 분 50% 길 되며 솔루션 조직 섹션 수돗물으로 슬라이드 하 고 반복이 여러 번 슬라이드는 분명, 섹션 보라색 남아 때까지. 0.02% 암모니아 물 청소법으로 슬라이드를 찍어 (2-3 번 찍어). 암모니아 물 수돗물으로 교체 하 고 세척 슬라이드 3-5 시간. 슬라이드 장착 15 분 동안 60 ° C에 또는 RT까지 완전히 공기 순환 오븐에서 슬라이드 건조 건조. 각 섹션에 각 슬라이드 및 장소 coverslips에 장착 시 약 1-2 방울을 놓습니다. 공기 방울의 모든 트래핑을 하지 마십시오. 공기 건조 5 분 이상에 대 한 슬라이드.참고: 빠른 레드 기판은 알코올에 민감한. 알코올에 슬라이드를 탈수 하지 마십시오. 시각화 표준 명시 야 현미경 슬라이드를 관찰 합니다.
Representative Results
현장에서 교 잡 시험 워크플로:흐름과 그림 1 에 표시 된 4 개의 부분으로 구성 됩니다: permeabilization 셀 이나 조직 대상 검색 및 효소 솔루션, 대상 RNA, 프로브의 교 잡의 신호 증폭, 및 신호의 시각화. 신호 수 있습니다 또한 측정할 수 디지털 이미징 소프트웨어 시스템을 사용 하 여 또는 반 양적으로 셀 당 도트 수에 따라. 그림 2 에 설명 된 수동 절차 또한 완전히 상업적인 자동 염색 시스템에 자동 되었습니다. Exon 접합 탐지 (EGFRvIII 스플라이스 변형)에 대 한 대표적인 얼룩: EGFRvIII constitutively 활성 종양 신호7로 이어지는 exons 7, 2의 프레임에 게놈 삭제에서 발생 하는 상피 성장 인자 수용 체의 변종 이다 . 분석 결과 FFPE 세포종 (GBM) 종양 샘플에서 EGFRvIII 상태를 식별 하기 위해 사용 되었다. 단일 이중 Z 프로브 중 WT를 검출 하기 위하여 exon 연결 되도록 설계 되었습니다 돌연변이, 또는 두 사본 (그림 3A). EGFRvIII 전용 프로브 스팬 1과 8 (E1/E8) exons의 동안 WT EGFR 프로브 exons 1과 2 (E1/E2) 또는 exons 7과 8 (E7/E8)의 접속점 스팬. 8, 9 (E8/E9) exons의 교차점에 걸쳐 일반적인 프로브도 총 EGFR (WT와 EGFRvIII 증명서)를 검출 하 사용 되었다. 모든 감지기 했다 다음 FFPE GBM 샘플에서 EGFR 상태를 결정 하는 데 사용 됩니다. 그림 3B 에 표시 된 두 개의 대표적인 예는 더 큰 연구에서 촬영 됐다. EGFR 상태는 독립적인 방법, RT-PCR에 의해 확인 되었다. 두 WT 프로브는 두 샘플 WT EGFR (그림 3B) 익스프레스 나타내는 두 샘플에서 신호를 감지. 그러나, 돌연변이 프로브만 EGFRvIII + 샘플,이 샘플은 실제로 EGFRvIII 변종 (그림 3B, 왼쪽된 패널)에 대 한 긍정적인 확인 신호 감지를 보여주었다. 반대로, 돌연변이 프로브 EGFRvIII-샘플 (그림 3B, 오른쪽 패널)에서 신호를 검색 하지 못했습니다. 함께 찍은, 이러한 결과 exon 접합 분석 결과 GBM FFPE 종양 샘플에서 EGFRvIII 상태를 확인할 수 있습니다 보여 줍니다. 짧은 목표를 위해 얼룩이 지기 대표:CDR3, 또는 보완 결정 지역 3, T-세포 수용 체에 높은 변수 도메인입니다. 일반적으로, CDR3 시퀀스는 아주 짧은; 예를 들어 Jurkat T-셀 라인에서 CDR3 α와 β 시퀀스는 길이, 51 및 48 뉴클레오티드 각각 (그림 4A). Jurkat 세포, CDR3 센스 조사에에서 표현 된 특정 CDR 시퀀스를 식별 하 α와 β Jurkat T 세포에 표현 되는 생성 된, 감각 CDR3 조사 이외에 α와 β로 부정적인 제어 프로브. 모든 프로브 다음 분석 결과 함께 준비 하는 FFPE Jurkat 세포에서 테스트 되었습니다. 관찰 되었다 강력한 얼룩 방지 감지 프로브 두 CDR3에 대 한 α 및 β Jurkat 세포에 감지 프로브 반면 감지 더 작은 신호 (그림 4B). 이러한 결과 T 세포 수용 체의 클론에 대 한 매우 다양 하지만 짧은 CDR 시퀀스 간의 분별 짧은 대상 분석 결과 수를 보여 줍니다. 대표 지점 돌연변이 EGFR L858R에 대 한 얼룩:점 돌연변이 프로브 종양 컨텍스트에서 단일 염기 변이 및 작은 삽입 또는 삭제 (INDELs) 검출 하기 위하여 개발 되었다. 그림 5A 는 제자리에서 점 돌연변이 EGFR L858R의 감지 능력을 보여 줍니다 (2573T > G). 2 프로브 설계 되었습니다: 하나는 L858R 검출 돌연변이 EGFR 시퀀스와 EGFR L858 WT 시퀀스를 감지. 두 프로브 두 FFPE 준비 셀 라인에서 테스트 되었습니다:만 표현 하는 EGFR L858 WT; H2229 그리고는 EGFR L858R 돌연변이 heterozygous H1975. L858R 돌연변이 프로브만 H1975 셀 라인 H2229 셀 라인에만 신호를 감지. 그러나, WT 프로브 두 셀 라인에서 신호를 감지합니다. 마찬가지로, 제자리에서 점 돌연변이 KRA G12A의 탐지를 시각화 그림 5B (35 G > C). 2 프로브 KRA G12A 산 및 KRA G12 WT 시퀀스를 감지 하도록 설계 되었고 HuT78 셀 라인 (이 표현 하는 KRA G12 WT)와 (는 KRA G12A 돌연변이 heterozygous) SW116 셀 라인에서 테스트. KRA G12 WT 프로브 두 셀 라인에서 신호를 감지 하는 동안 KRA G12A 프로브만 SW116 셀 라인에 신호 감지. 함께 찍은, 이러한 데이터는 세포 및 조직 맥락에서 단 하나 뉴클레오티드 동 질 다 상 검출에서 점 돌연변이 분석 결과의 기술적 능력을 보여 줍니다. 대표 자동 제자리에 분석 결과 대 한 얼룩:자동화 된 분석 실험 허용 샘플의 더 많은 수 더 안정적으로 실행 되도록 간 사용자 가변성 및 실습 시간을 최소화 하 고 일관 되 게 재현할 결과 생성 합니다. 따라서, 분석 결과의 자동된 버전은 개발 되었다. 이 분석 결과 함께 자동화 된 얼룩이 보여, 스플라이스 변종 METΔ14의 탐지는 시험 되었다. 이 이체는 사전-mRNA 접합, 제정 활성화, 메트로 수용 체8,9의 종양 변환 하는 동안 생략 되 고 메트로 유전자에서 exon 14의 결과. 특히 METΔ14 변종 감지, 2 개의 exon 접합 프로브 설계 되었습니다: exons 13 및 15 (E13/E15) METΔ14 변형 사본을 감지 하의 걸쳐와 exons 14 및 15 (E14/E15) WT 만난 감지 하의 걸쳐 대 본 (그림 6A)입니다. 두 프로브 다음 2 FFPE 준비 셀 라인에서 테스트 되었습니다: METΔ14 변종 표현, H596 및 A549, WT 만난 유전자 표현. 두 프로브 E13/E15 프로브만 H596 세포와만 (그림 6B 와 6 C) A549 세포에서 신호를 감지 E14/E15 프로브에 신호를 감지 상호 배타적 표현 패턴을 보였다. 마지막으로, dapB에 대 한 조사 (그림 6B 와 6 C) 배경 신호를 나타내는 아무 신호를 보여주었다. 전반적으로,이 데이터는 메트로 변형 METΔ14에 현장에서 자동된 BaseScope 분석 결과 활용 하 여 특정 검색을 보여 줍니다. 그림 1 : 분석 결과 워크플로. 워크플로 4 주요 단계로 구성 됩니다: 전처리 permeabilize 세포 또는 조직, 대상 RNA, 교 잡 조사를 증폭, 신호 및 명시 또는 형광 현미경 시각화 하 여 탐지 신호. 개별 점 디지털 이미지 분석 플랫폼을 사용 하 여 측정할 수 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오. 그림 2 : 수동 분석 결과 프로토콜의 그림. 전체 분석 결과 9 h. 전처리 보육 시간에 대하여 조직 전처리 권고에 대 한 사용자 설명서의 부록 A를 참조 하는 것이 좋습니다 그래서 번 조직 유형에 따라 다를 수 있습니다에 완료할 수 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오. 그림 3 : 엑손 접합 탐지의 대표 이미지. (A) 표시 여기는 EGFR WT 및 EGFRvIII 내용은 exon 기구 EGFR WT 또는 EGFRvIII 교차점에 걸쳐져 더블 Z exon 접합 프로브를 묘사 하는 회로도. (B)는 exon 접합 분석 결과 긍정적인 제어 프로브, POLR2A, 및 부정적인 제어 프로브, dapB 뿐만 아니라 (A)에 나열 된 프로브를 사용 하 여 두 FFPE 세포종 샘플에서 수행 되었다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오. 그림 4 : 짧은 대상의 대표 이미지 시퀀스 검색. (A) 표시 여기는 Jurkat 세포 CDR3 시퀀스. 블랙에 시퀀스 측면에 서 일반적인 순서 이며 빨간색에서 순서는 CDR3α 또는 CDR3β에. 단일 이중 Z 짧은 대상 시퀀스 프로브가이 시퀀스에 대 한 설계 되었습니다. (B) 짧은 대상 분석 결과 Jurkat 세포 (a), 시퀀스를 대상으로 하는 안티 감각 또는 감각 프로브를 사용 하는 FFPE 셀 펠 릿으로 준비에 수행한 그리고 dapB 부정적인 제어로 사용 되었다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오. 그림 5 : 점 돌연변이 탐지의 대표 이미지. (A) 분석 결과 H2229 세포 (EGFR L858 homozygous)와 H1975 세포 (EGFR L858R 돌연변이 heterozygous) EGFR L858 WT 시퀀스 또는 EGFR L858R를 대상으로 단일 더블 Z 포인트 돌연변이 프로브를 사용 하는 FFPE 셀 펠 릿으로 준비에서 수행 되었다 변이 된 시퀀스입니다. (B) 점 돌연변이 분석 결과 HuT78 셀 (KRA G12A homozygous) 및 SW116 셀 (KRA G12A 돌연변이 heterozygous) KRA G12 WT 시퀀스를 대상으로 하는 단일 더블 Z 포인트 돌연변이 프로브를 사용 하는 FFPE 셀 펠 릿으로 준비에 수행 되었다 또는 KRA G12A 돌연변이 시퀀스입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오. 그림 6 : 엑손 접합 분석 결과 함께 자동화 된 얼룩의 대표 이미지. (A) 표시 여기 만난 WT 및 METΔ14 성적표와 만난 WT 또는 METΔ14 교차점에 걸쳐져 단일 더블 Z exon 접합 프로브를 묘사 하는 회로도 exon 조직입니다. (B) (C) 자동화 된 exon 접합 분석 결과 부정적인 제어 프로브 dapB 뿐만 아니라 H596 셀 (METΔ14 표현)와 A549 세포 (만난 WT 표현) (A)에 나열 된 프로브를 사용 하는 FFPE 셀 펠 릿으로 준비에 수행 되었다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오. Exon 접합 짧은 시퀀스 점 돌연변이 변형/isoform를 결합 50 및 300 nt 사이 시퀀스 점 돌연변이 원형 RNA (circRNA) 높은 동종 시퀀스 짧은 indel 유전자 융해 TCR 클론 CDR3 시퀀스 편집 진 유전자 녹아웃 (KO) 사전-미르 작은 nucleolar RNA (snoRNA) 편집 진 표 1: 응용 프로그램은 제자리에서 분석 결과. 이 분석 결과의 응용 프로그램에 대 한 3 주요 종류가 있다: 엑손 접합, 짧은 대상 시퀀스, 그리고 점 돌연변이. 각 열에 나열 된 각 범주에 대 한 몇 가지 특정 응용 프로그램 예입니다.
Discussion
이 보고서에서 소설 틱 분석 결과 프로토콜 및 응용 세부 사항에서 토론 되었다. 분석 결과 exon 접합, 짧은 대상과 높은 동종 시퀀스 및 조직 컨텍스트에서 점 돌연변이의 직접적인 시각화 수 있습니다. 분석 결과 RNAscope 기술5 기반 이며 따라서 단일 분자 검출 가능 합니다. 그러나, 때문에 고급 증폭 시스템 신호 감지할 수 있습니다 조금 한 더블 Z 쌍이 들어 있는 프로브 또는 그냥 50 뉴클레오티드의 대상 서식 파일 길이. 프로브 길이에서 단일 더블 Z로 짧은 있을 수 있습니다, 때문에 exon 접합, 짧은 대상과 높은 동종 시퀀스, 점 돌연변이 (표 1)의 검출에 대 한 수 있습니다.
분석 결과의 성공적인 성능에 대 한 여러 기술 권장 있다. 첫째, 조직 16-32 h10에 대 한 상 온에서 신선한 10% 중립 버퍼링 말린 (NBF)에 고정 되어야 한다. Underfixation ( 32 h) 분석 결과의 성능에 악영향을 줄 것 이다 고 추가 최적화 필요할 수 있습니다. 둘째, 강력한 프로브 교 잡 및 신호 증폭에 필요한 온도 습도의 최적 제어를 보장 하기 위해 처리 시스템 및 교 잡 오븐 슬라이드 사용 해야 프로토콜 단계 5 2.3 (protease 전처리, 프로브 교 잡, 신호 증폭, 및 신호 감지). 셋째, 초과 잔여 버퍼 프로토콜을 통해 각 단계 전에 제대로 decanted (하지만 너무 많은 조직 섹션 건조 되도록) 해야 합니다. 슬라이드 밖으로 건조, 중요 한 일반적인 신호 개발할 것입니다. 넷째, 조직의 종류에 따라 전처리 최적화 할 수 있습니다. 잘못 된 프로 테아 제를 사용 하 여 또는 시간의 차선의 길이 대 한 발생할 수 있는 아래-또는 오버-digestion 그리고 신호에 부정적인 영향을 미칠 것 이다. 마지막으로, 그것은 항상 긍정적이 고 부정적인 컨트롤 테스트 프로브와 함께 실행 하는 것이 중요입니다. 네거티브 제어 프로브는 샘플에서 RNA 품질을 테스트 조사 결과 해석에 대 한 최적의 그 배경 신호, 그리고 긍정적인 통제 조사 분석 결과 올바르게 완료 되었습니다 확인 합니다. 경우의 긍정적인 제어 프로브 신호 샘플에서 RNA 품질 높습니다 차선 및 신호 테스트 프로브 볼 수 없습니다 수 있습니다.
수동 분석 결과 이외에 자동화 된 stainers에 분석 결과 수행 하는 능력은 또한 시연된 (그림 6). 이 자동화 된 분 분석 결과 수익률 높은 신호 대 잡음 비율 및 표 1;와 같이 동일한 응용 프로그램에 대 한 적용 그러나, 자동화 된 분석 결과의 혜택 분석 결과 조건, 간 사용자 가변성 및 실습 시간의 최소화의 표준화를 포함 하 고 신뢰할 수 있는 방식으로 조직 샘플의 높은 처리량 검열에 대 한 수당.
Immunohistochemistry (IHC)와 qRT-PCR FFPE 임상 표본에서 결합 이체 (특히 EGFRvIII)의 검출에 대 한 허용, 이러한 기술은 필요한 특이성 부족 수 고는 결합의 공간 해상도에 대 한 통찰력을 제공 하지 않습니다. 변형 식, 각각11,12. 이 프로토콜에 분석 결과의 주요 장점은 형태학 상 조직 컨텍스트를 유지 하면서 스플라이스 연결의 그것의 높게 과민 하 고 특정 시각화 이다. 여기, 분석 결과 능력을 정확 하 게 METΔ14, EGFRvIII 등 여러 스플라이스 변종에 대 한 독특한 exon 접합 대상 시연 (그림 3과 6) 했다. 또한, 분석 결과 전립선 암, 뇌, ErbB4의 여러 개의 isoforms 및 원형 RNA Cdr1as 마우스 뇌3,,1314의 녹아웃의 확인 스플라이스 변종 아칸소-v 7을 감지 하 보였다.
이 분 분석 결과 의해 짧은 대상 시퀀스 검출 CDR3 시퀀스 Jurkat 세포 (그림 3)에서 파생 된의 탐지에 의해 증명으로 짧은 길이, 50 뉴클레오티드 RNA 시퀀스의 시각화에 대 한 수 있습니다. 분석 결과 또한 Revêchon 외와 같이 매우 다른 가족 구성원 또는 종, 동종은 유전자 시퀀스를 검색할 수 있습니다., 누가 마우스 피하 흰색 adipose 조직15에서 표현 하는 인간의 progerin를 검출 하기 위하여 짧은 대상 분석 결과 사용. 또한, 작은 nucleolar RNA (snoRNA), CRISPR 중재 하는 유전자, 편집과 전조 예측에 관한 발견 현장에 짧은 대상 분석 결과 함께 될 수 있습니다. 더 최근에, 푸 외 IHC 표현 사전-미르 mir125b16망막에 정확한 셀을 식별 하기 위해이 분 분석 결과 결합.
종양에 프로 파일링 하는 돌연변이 종양의 진행을 공부 하 고 표적으로 한 치료를 개발 중요 합니다. 돌연변이 프로 파일링 하는 것은 높은 처리량 시퀀싱을 통해 달성 될 수 있다,이 기술은 intratumoral 이종 또는 링크 유전 변경 세포 형태학17,18로 다루는 완전히 수 없습니다. 점 돌연변이이 분 분석 결과 사용 하 여 검색 셀 라인 (그림 5)에서 EGFR L858R와 KRA G12A 단일 염기 변이의 탐지에 의해 검증으로 단일 기본 해상도에서 RNA 대상 시퀀스의 구별에 대 한 수 있습니다. 또한, 베이커 외. 대 장 암18에서 BRAF, KRA, 및 PIK3CA oncogenes에 여러 돌연변이 대상으로 점 돌연변이 분석 결과 사용 합니다. 그들은 식별 하 고 공간적으로 종양 세포, 궁극적으로 그들은 내 종양이 질에 어떻게 공헌 하는지 보여주는의 드문 돌연변이 subclones를 지도 했다.
요약 하자면, 전문화 된 RNA 분 분석 결과 개발 되었습니다. 이 방법론은 스플라이스 이체, 짧은 시퀀스, 그리고 제자리에변이의 탐지에 대 한 수 있습니다. 그것은 민감한, 정량, 구체적이 고 적응력이 성능 모두 수동 방법으로 자동화 된 stainers 에입니다.
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Materials
| HybEZ Oven (110 or 220 VAC) or HybEZ II Oven (110 or 220V) | ACD | 310010 or 310013 (HybEZ™), 321710 or 321720 (HybEZ™ II) | |
| HybEZ Humidity Control Tray (with lid) | ACD | 310012 | |
| ACD EZ-Batch Slide Rack (20 slide capacity) 1 rack 310017 | ACD | 310017 | |
| HybEZ Humidifying Paper | ACD | 310015 | |
| ImmEdge Hydrophobic Barrier Pen (required) | Vector Laboratory | H-4000 | |
| SuperFrost Plus Slides (required) | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| 10% neutral-buffered formalin (NBF) | MLS | / | MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier. |
| Paraffin wax | MLS | / | MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier. |
| Microtome | MLS | / | MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier. |
| Gill’s Hematoxylin I | American Master Tech Scientific/MLS | HXGHE1LT | MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier. |
| Xylene | Fisher Scientific/MLS | X3P-1GAL | MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier. |
| Tissue-Tek Vertical 24 Slide Rack | American Master Tech Scientific/MLS | LWSRA24 | MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier. |
| Tissue-Tek Staining Dishes | American Master Tech Scientific/MLS | LWT4457EA | MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier. |
| Tissue-Tek Clearing Agent Dishes, xylene resistant | American Master Tech Scientific/MLS | LWT4456EA | MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier. |
| 100% alcohol (EtOH) | American Master Tech Scientific/MLS | ALREACS | MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier. |
| VectaMount Permanent Mounting Medium (required) | Vector Labs | H-5000 | |
| Cover Glass, 24 x 50 mm | Fisher Scientific/MLS | 12-545-F | MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier. |
| Ammonium hydroxide, 28–30% | Sigma-Aldrich/MLS | 320145-500mL | MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier. |
| Carboy (>3L) | MLS | / | MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier. |
| Oster Steamer Model 5712, Black and Decker Steamer HS3000, or the Braun Multiquick FS 20 Steamer | / | / | |
| Digital thermometer | MLS | / | MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier. |
| Water bath or incubator, capable of holding temperature at 40 +/– 1°C | MLS | / | MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier. |
| Pipettors and tips, 1–1000 μL | MLS | / | MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier. |
| Distilled water | MLS | / | MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier. |
| Tubes (various sizes) | MLS | / | MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier. |
| Fume hood | MLS | / | MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier. |
| Graduated cylinder | MLS | / | MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier. |
| Parafilm | MLS | / | MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier. |
| Paper towel or absorbent paper | MLS | / | MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier. |
| Microcentrifuge | MLS | / | MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier. |
| Microscope and accessories | MLS | / | MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier. |
| Drying oven, capable of holding temperature at 60 +/– 1°C | MLS | / | MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier. |
| Formaldehyde | MLS | / | MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier. |
| Histogel | Fisher Scientific/MLS | 22-110-678 | |
| BaseScope Reagent Kit – RED | Advanced Cell Diagnostics | 322900 | |
| BaseScope Hs-EGFR-E1E2 | Advanced Cell Diagnostics | 701701 | |
| BaseScope Hs-EGFR-E1E8 | Advanced Cell Diagnostics | 701711 | |
| BaseScope Hs-EGFR-E7E8 | Advanced Cell Diagnostics | 701721 | |
| BaseScope Hs-EGFR-E8E9 | Advanced Cell Diagnostics | 701731 | |
| BaseScope Hs-MET-E14E15 | Advanced Cell Diagnostics | 701811 | |
| BaseScope Hs-MET-E13E15 | Advanced Cell Diagnostics | 701801 | |
| BaseScope Hs-KRAS-G12A | Advanced Cell Diagnostics | 705491 | |
| BaseScope Hs-KRAS-G12-nt35WT | Advanced Cell Diagnostics | 705531 | |
| BaseScope Hs-EGFR-L858R | Advanced Cell Diagnostics | 705451 | |
| BaseScope Hs-EGFR-L858WT | Advanced Cell Diagnostics | 705461 | |
| BaseScope Control Probe Pack Human | Advanced Cell Diagnostics | 322975 |
Riferimenti
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Citazione di questo articolo
Anderson, C. M., Laeremans, A., Wang, X. M., Wu, X., Zhang, B., Doolittle, E., Kim, J., Li, N., Pimentel, H. X. Y., Park, E., Ma, X. Visualizing Genetic Variants, Short Targets, and Point Mutations in the Morphological Tissue Context with an RNA In Situ Hybridization Assay. J. Vis. Exp. (138), e58097, doi:10.3791/58097 (2018).