Bir yüksek-den geçerek Cre-Lox Viral membran Fusion tahlil inhibitörleri HIV-1 Viral membran füzyon tanımlamak için aktive
Summary
HIV-1 füzyon yoluyla üzerinde akış sitometresi veya floresan mikroskopi tarafından algılanabilir yeşil flüoresan proteinin ifade bildirmek için bir hücre tabanlı tahlil açıklar. İnhibitörleri (füzyon aşamada özellikle) viral girdisinin boş hücre ve hücre-hücre enfeksiyonu sistemlerinde test etmek için kullanılabilir.
Abstract
Bu tahlil akış sitometresi veya floresan mikroskopi tarafından özellikle HIV-1 füzyon yoluyla üzerinde yeşil flüoresan protein (GFP) tespit ifade bildirmek için tasarlanmıştır. HIV-1 muhabir virüsü (HIV-1 Gag-iCre) matrix ve Gag polyprotein kapsid protein arasındaki HIV-1 genom içine Cre recombinase ekleyerek oluşturulur. O zaman bir hedef hücreye piyasaya Cre recombinase virüs parçacıkları, içine bir ambalaj içinde bu sonuçlar stabil bir Cre recombinase aktif kırmızı floresan protein (RFP) GFP anahtarı kaset ifade satır. Bazal durumda, sadece RFP bu kaset ifade eder. Hedef hücre içine Cre recombinase teslimini loxP siteleri tarafından çevrili RFP, excises, GFP ifadede kaynaklanan. Bu tahlil herhangi bir inhibitörleri (füzyon aşamada özellikle) viral girdisinin boş hücre ve hücre-hücre enfeksiyonu sistemlerinde test etmek için kullanılan ve bir sınıf purinergic reseptör antagonistleri, HIV-1 viral membran füzyon roman inhibitörleri tanımlamak için kullanılan.
Introduction
Roman antiretroviral tedavi ihtiyacını yüksek üretilen iş ekranları inhibitörleri HIV-1 giriş için geliştirilmesi açtı. Gag-iCre muhabir tahlil inhibitörleri viral girişinin füzyon adımda bir hücre hücre enfeksiyon sisteminde özellikle viral membran füzyon konak hücre zarının1ile ölçerek tanımlamak için geliştirilmiştir. Bir tahlil geliştirilmiştir için özellikle HIV-1 enfeksiyonu viral membran erime noktasına kadar erken aşamalarında hareket roman inhibitörleri ekran. Yeni enfeksiyon ölçme giriş hücrelerden ayırt etmek zor bu yüzden ilk inoculum enfekte donör hücreleri ve ininfected hedef hücreleri, içerir hücre-hücre enfeksiyon ölçüm için bir meydan okuma olduğunu. İdeal sistem bir hedef hücre enfeksiyonu başlatma tarafından indüklenen Contegra gen işaret yer alacağı ve donör hücrede mevcut değil. Popüler bir viral içeriği bir viral protein-enzim fusion, bam-Vpr, dayalı tahlil karıştırma etkili, olabilir ama yüksek işlem hacmi, hücre-hücre tarama2için sınırlamalar vardır. Bu tahlil için HIV-1 Vpr erimiş, virions paketlenmiş ve hedef hücrelere viral membran fusion üzerine teslim bir beta-lactamase (BAM) muhabir gen içerir. CCF2-AM substrat hedef hücre sitoplazma yüklenir ve bir floresan değişimi bölünme üzerine geçer. CCF2-AM substrat pahalı ve yüksek üretilen iş ekranlar için engelleyici olabilir. Boya-etiket için gerekli donör ve hedef hücreleri ayırmak için hedef nüfus. Son olarak, protokol bileşikler çok sayıda test ederken ağır ve pahalı olabilir birkaç yıkama ve kuluçka adımları gerektirir.
Gag-iCre tahlil yüksek-den geçerek inhibitörleri füzyon hücre hücre iletim için eleme geliştirmek için bu sorunlara bir çözüm olarak geliştirilmiştir. Bu sistem substrat hücrelere yüklenecek gerektirmez. Tahlil boş hücre çalışmaları için de kullanılabilir ve sözde yazılı HIV-1 Gag-iCre virüs partikülleri kullanarak diğer viral füzyon çalışmalar için uyarlanabilir. HIV-1 Gag-iCre tahlil3,4,5gibi bunlar gerçek virüs parçacıkları kullanmayın ancak HIV Env aracılı hücre-hücre füzyon deneyleri virüs Env protein aracılı hücre füzyon, ölçebilirsiniz. Bu tahlil akış sitometresi veya floresan mikroskobu ile okunabilir. FDA kütüphane yanı sıra küçük bir kütüphane purinergic inhibitörleri1,6ekran için başarılı bir şekilde kullanılmıştır. Diğer Müfettişler ayrıca virüs kapsüllenmiş beta-lactamase transfer sitoplazma7,8 içine raporlar bir adapte ve optimize edilmiş yüksek üretilen iş füzyon tahlil kullanarak HIV-1 Fusion purinergic inhibitörleri belirledik .
Gag-iCre virüs Cre recombinase matris ve kapsid, HIV-1 proteaz siteleri9tarafından çevrili arasında ekleme Gag-iGFP virüse benzer bir yaklaşım ile tasarlanmıştır. Cre enzim HIV-1 proteaz doğmakta olan virüs parçacık içinde aktif hale getirildiğinde olgunlaşır Gag polyprotein içinde eklenen bir habercisi olarak yapılır. Cre teslim, böylece, bir proteaz aktif HIV-1 parçacık içeriğini teslim bir hedef hücre ile bir viral membran füzyon süreci içine üzerine bağlıdır. Protokol iki sürümleri burada verilmektedir. İlk hedef hücreleri doğrudan hücre hücre iletim HIV çalışmaya, enfekte HIV-1 enfekte nüfus kullanır. Boş hücre viral bir enfeksiyon çalışma için bir boş hücre virüs ikinci sürümü kullanır. Hücreleri zaten çözdürülen pasajlı ve hücre-hücre iletim tahlil hücreleri çözdürülen günden tamamlamak için 7 gün veya 5 gün alır. Hücreleri çözdürülen pasajlı varsa ve boş hücre enfeksiyon tahlil 5 hücreleri çözdürülen gerekiyorsa, gün ve 3 gün içinde gerçekleştirilir. Ayrıca hücreye Clevers laboratuvar10tarafından oluşturulan bir plazmid kullanarak (önceden varolan RG hedef hücre kültürünü değil kullanılıyorsa) istenen bir RG (kırmızı-yeşil) hedef hücre satırı oluşturmak için verilen talimatları. Bu virüs ve virüs ifade hücreleri bu tahlil ile uygun Biyogüvenlik önlemleri alınır tavsiye edilir. Biz bu tahlil BSL2 + doku kültürü tesiste bulaşıcı bölümü kuralları. Hücreleri sabit sonra onlar standart akış sitometresi ve mikroskopi tesislerinde analiz edilebilir.
Roman, maddeler ve birleşimler için bu testin uygulama ekrana burada tarif biz HIV-1 viral membran füzyon (Şekil 1) inhibe. Pro-inflamatuar aracılar Purinergic reseptörleri vardır. Bizim Laboratuvar purinergic reseptörlerinin non-selektif inhibitörü HIV-1 viral membran füzyon6inhibitörleri hareket göstermiştir. Biz yüksek üretilen iş bu tahlil kullanımı yeni HIV-1 viral membran füzyon inhibitörleri tanımlayabilirsiniz raporu. Biz bir inhibitörü reseptörlerinin purinergic sınıfının HIV-1 viral membran füzyon inhibitörleri roman bir sınıfın temsil ettiğini göstermek.
Protocol
Representative Results
Discussion
Gag-iCre tahlil viral çoğaltma füzyon adımında inhibe ilaç adaylarının eleme için çok yararlı olduğu kanıtlanmıştır. Bu tahlil yaparken en viral enfeksiyon deneyleri için iyi sinyal almak için en önemli adımları benzerdir. İlk kritik adım iyi kalite virüs yüksek titreleri üretiyor. Bu adımı 293T hücreleri olmasını gerektirir onlar overconfluent olmak ve birlikte yığın bu yüzden sık sık (en az 1 x her 48 h) pasajlı. Ayrıca, bazı araştırmacılar diğer lipid tabanlı reaktifler leh…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu araştırma hibe NIH/NIAID AI112423 ve Benjamin K. Chen için NIH/NIGMS GM113885 ve NIH/NIAID K08-AI120806 için Talia H. Swartz tarafından desteklenmiştir. Icahn School of Medicine, Mount Sinai Dekan’ın akış sitometresi çekirdek teşekkür etmek istiyorum.
Materials
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) | Sigma Aldrich | D5546 | Media for 293 Cells |
| RPMI-1640 | Sigma Aldrich | R0883 | Media for Jurkats |
| Fetal Bovine Serum Albumin | Gibco | 16140-071 | Serum for 293 Cells |
| Cosmic Calf Serum | Hyclone | SH30087.03 | Serum for Jurkat Cells |
| Hyclone Pennecillin Streptomycin solution | GE Healthcare Life sciences | SV30010 | Penn/Strep used in both media |
| T75 Flasks | Corning | 3073 | Used for Culture of Jurkat Cells |
| 10cm Tissue Culture Plates | Corning | 430167 | Used for Culture of 293 Cells |
| 96 Well Plates (tissue culture Treated) | Corning | 3595 | Used for fusion assay |
| Polyjet Transfection Reagent | Signagen | SL100688 | Used to transfect 293 Cells |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline | Sigma Aldrich | D8537-100ML | Used in wash steps |
| Hyclone Trypsin Protease | GE Healthcare Life sciences | SH30042.01 | For Trypsinization of 293 cells |
| Amaxa Cell Line Nucleofector Kit V | Lonza | VACA-1003 | For Nucleofection of Jurkats |
| Ficoll-Paque plus | GE Healthcare Life sciences | 17144002 | For Nucleofection of Jurkats |
| Serological Pipettes | Fisher Brand | 13-678-11E | For all tissue culture |
| Pipettor Tips | Denville Scientific | P3020-CPS | For all tissue culture and liquid handling steps |
| Millex Syringe Filter (0.45 micron) | Millipore | SLHA033 | For filtration of virus |
| BD Slip Tip Sterile syringes | BD Diagnostics | 309656 | For filtration of virus |
| Amaxa Nucleofector | Lonza | 2b | for Nucleofection of Jurkats (various models available) |
| BD Fortessa Flow Cytometer | BD Biosciences | for flow cytometry analyss of samples | |
| Tissue Culture Hood | Various models | Fortessa 2 | |
| pMSCV-loxp-dsRed-loxp-eGFP-Puro-W PRE | Addgene | 32702 | Koo BK et al. Controlled gene expression in primary Lgr5 organoid cultures. Nature Methods 9:81-83 (2011). |
| pCL10a1 | Novus Bio | NBP2-29542 | Naviaux, RK, Costanzi, E, Haas, M and Verma, I. The pCL vector system: Rapid production of helper-free, high titer, recombinant retroviruses. Journal of Virology 70: 5701-5705 (1996) |
| Gag-iCre | Benjamin Chen Lab | Esposito AM et al. A high throughput Cre-lox activated viral membrane fusion assay identifies pharmacological inhibitors of HIV entry. Virology 490:6-16 (2016). |
Riferimenti
- Esposito, A. M., et al. A high throughput Cre-lox activated viral membrane fusion assay identifies pharmacological inhibitors of HIV entry. Virology. 490, 6-16 (2016).
- Cavrois, M., De Noronha, C., Greene, W. C. A sensitive and specific enzyme-based assay detecting HIV-1 virion fusion in primary T lymphocytes. Nature Biotechnology. 20, 1151-1154 (2002).
- Huerta, L., Lamoyi, E., Baez-Saldana, A., Larralde, C. Human immunodeficiency virus envelope-dependent cell-cell fusion: a quantitative fluorescence cytometric assay. Cytometry. 47, 100-106 (2002).
- Sakamoto, T., et al. Establishment of an HIV cell-cell fusion assay by using two genetically modified HeLa cell lines and reporter gene. Journal of Virological Methods. 114, 159-166 (2003).
- Herschhorn, A., et al. An inducible cell-cell fusion system with integrated ability to measure the efficiency and specificity of HIV-1 entry inhibitors. PLoS One. 6, e26731 (2011).
- Swartz, T. H., Esposito, A. M., Durham, N. D., Hartmann, B. M., Chen, B. K. P2X-selective purinergic antagonists are strong inhibitors of HIV-1 fusion during both cell-to-cell and cell-free infection. Journal of Virology. 88, 11504-11515 (2014).
- Marin, M., et al. High-Throughput HIV-Cell Fusion Assay for Discovery of Virus Entry Inhibitors. Assay and Drug Development Technologies. 13, 155-166 (2015).
- Giroud, C., et al. Screening and Functional Profiling of Small-Molecule HIV-1 Entry and Fusion Inhibitors. Assay and Drug Development Technologies. 15, 53-63 (2017).
- Hubner, W., et al. Sequence of human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) Gag localization and oligomerization monitored with live confocal imaging of a replication-competent, fluorescently tagged HIV-1. Journal of Virology. 81, 12596-12607 (2007).
- Koo, B. K., et al. Controlled gene expression in primary Lgr5 organoid cultures. Nature Methods. 9, 81-83 (2011).
- Pear, W. S., et al. Production of high-titer helper-free retroviruses by transient transfection. Proceedings of the National Academy of Sciences. 90, 8392-8396 (1993).
- Naviaux, R. K., Costanzi, E., Haas, M., Verma, I. The pCL vector system: Rapid production of helper-free, high titer, recombinant retroviruses. Journal of Virology. 70, 5701-5705 (1996).
- Kingston, R. E., Chen, C. A., Okayama, H. Calcium Phosphate Transfection. Current Protocols in Immunology. 10, 10-13 (2001).
