c57bl6 小鼠耳蜗植入术与电唤起脑干反应记录

所有程序都是根据瑞士巴塞尔大学、动物护理和准则进行的。他们获得了瑞士巴塞尔州兽医办公室的许可。 请注意:本研究采用了8–12周 (体重20-30 克) 的 c57bl6 成年小鼠。左耳被用作实验耳朵。右耳作为动物内部的控制, 并没有手术改变。 1. 术前程序 在手术前30分钟通过腹膜内注射酮胺/氯胺 (80 mg/kg 氯胺酮, 16 mg/kg xylazine, i. p., 以10μlg 体重注射的体积) 对动物进行麻醉。 必要时补充麻醉, 判断由积极的踏板和眼睑 (脚趾捏) 反射和胡须的运动, 与较低剂量的氯胺酮 (45 mg/kg, i. p., 注射在10μlg 体重)。根据机构准则, 可以替代制剂和剂量制度。注: 一般情况下, 动物将需要注射每45–60分钟与此代理和剂量的制度。从最初切口到植入电极阵列周围闭合的平均时间通常为 1-1. 5小时。 检查动物的充分镇静, 其特点是有规律的呼吸速度和缺乏脚趾捏反射。保持这种麻醉水平。 用闭环加热垫将动物的体温保持在36.6°c。使用眼药膏, 以避免角膜脱水。这也会抑制动物的眨眼反射, 这会给重新编码增加噪音。 通过皮下注射布比卡奈/利多卡因 (0.1 mg/bup每当 aine 和 0.4 mg/llidocaine, 0.1 ml 给药的 s. c.) 进行局部镇痛, 以尽量减少任何手术不适。根据机构准则, 可以替代制剂和剂量制度。 在颈部服用肌力拮抗剂阿托品 (阿托有权氨基, 0.1 mg/ml, 20μl 给药…, 溶于 pbs), 以减少粘液分泌, 促进呼吸。根据机构准则, 可以替代制剂和剂量制度。 2. 震耳欲聋前声学听觉脑干反应 (aabr) 注: aabr 用于测量震耳欲聋前后的听力状态。测试在左耳和隔音电屏蔽的展台上进行。我们建议测试并在以后为右撇子植入左耳。关于小鼠 abr 的更多细节可以在13,14中找到。tucker davis technologies (tdt) 硬件和软件 (biosig) 用于记录 abr, 但可以使用其他系统。 用声学泡沫阻断对侧 (右) 耳朵, 将 abr 响应与同侧 (左) 耳朵隔离。将泡沫放入1毫升注射器中, 然后将其注射到小鼠的右耳管中, 用泡沫覆盖整个耳道 (0.1-0.2 ml 泡沫)。确保注射器紧贴着耳朵密封, 以便泡沫一直进入耳道。 将扬声器放置在离左耳10厘米的位置。请注意:此设置的扬声器使用 pcb 麦克风进行了校准, 如反射15中所述。 用70% 的乙醇溶液清洁 abr 电极。将电极置于皮肤下方: 在顶点上有源 (ch1), 参考 (-) 在同侧耳朵的 pinna 下方, 并在后腿上研磨 (图 1)。 通过光纤端口将顶部和前放大器连接到听觉处理器。 检查有源电极和参考电极的阻抗。 如果阻抗超过3欧姆, 请重新排列它们并重新进行测量。当电极具有相同的阻抗时, 可以获得最佳记录。关闭隔音室。 使用复杂的听觉处理器和软件, 在自由场条件下显示 abr。标准化软件中的点击刺激: 0.1 ms 单通道单相点击显示在21赫兹;在 10个 db 步骤中, 点击级别从 90 db spl 降低到 10 db spl;10毫秒录制窗口。每个 db 级别的平均答复总数为512个。 离线应用 2, 000 hz 低通滤波器和 300 hz 高通滤波器, 使用定制的 matlab 脚本减少录制过程中的噪音。 确定 abr 阈值为具有可识别的 abr 波响应的最低 db 级别 (图 2,图 3)。 3. 手术 请注意:使用的典型仪器包括剪刀、手术刀、一对带直尖或弯曲尖端的金属钳子、组织牵引器工具、几个吸楔子和可吸收的纸点。手术是在左耳进行的。 将鼠标放在右侧。避免颈椎出现过度扭转的压力。一定要保持身体挺直, 保持气道畅通。 用剪刀剪下左耳后面的毛 (或用剃须刀刮胡子) 来暴露皮肤。用70% 乙醇溶液和 betadine (povidone/iodine/碘) 对皮肤进行消毒。 在显微放大 (16x) 下, 用手术刀做一个 1-1. 5 厘米的耳后切口。 切换到更高的显微放大倍率 (25x)。 用钳子对皮下脂肪层进行钝性解剖, 脂肪层的厚度可能各不相同。请注意:当颈外静脉穿过这个区域时, 要小心。对这种结构的损害会导致过度出血。 收回胸锁乳突肌, 露出鼓室骨膜。使用面神经作为一个关键的解剖地标, 以帮助识别听觉球囊。面神经包裹在胸锁乳突肌的后后侧-背侧边缘, 沿着耳道向松果横行。轻轻地将自固定牵引器工具放置在切口中, 以便于进入球囊 (图 4)。 取下覆盖在球囊内侧背侧区域的组织, 以便清晰地显示球囊和乳突过程之间的脊。 轻轻旋转一个 30 g 针刺穿球囊, 并在脊的后侧和上侧做一个洞 (球状造口) (骨头在这一边更薄)。或者, 使用牙科外科诊所。请注意:这和以下步骤可以通过更高的显微放大倍率 (40x), 如果首选。此外, 如果需要, 请更改显微镜的位置。最大限度地提高中耳间隙的手术视图是很重要的。 用细尖钳捏小骨头, 露出中耳腔, 从而拓宽球体。将球囊背向乳突过程延伸, 直到圆形窗位远离覆盖的骨头。稳定的动脉是颈内动脉的一个分支, 向圆形窗位运行。 注意不要损坏血管, 因为过多的出血可能是致命的。在内耳腔内按一小块海绵状, 可以阻止小出血。 将球岩头向前部向上向方向延伸, 以可视化支架, 中耳骨连接到椭圆形窗口。 用钳子取下支架, 以暴露椭圆形窗口。 4. 奥托洛克斯剂的圆窗应用 用一个钝的 30 g 针轻轻地打孔圆形窗户和椭圆形的窗户膜。检查是否有血段用完。 通过椭圆形窗口缓慢灌注0.05% 重量/体积新霉素溶解在 pbs 中 (调整到 ph 7.4)。液体应从圆形窗口中冲洗出来。在圆形窗口上重复相同的过程。请注意, 不要损坏用于灌注的针头的窗户骨骼结构。 在圆形窗和椭圆形窗位内放置一小块 (1 毫米2) 浸泡在新霉素中的海绵状斯坦。 取下牵引器工具, 关闭切口, 等待30分钟。 5. 震耳欲聋后声学 abr 以与震耳欲聋前类似的方式记录 aabr (步骤2.2 至 2.8) (图 2b,图 3)。 6. ci 电极阵列的插入 请注意:耳蜗内电极阵列由四个铂金带 (直径 0.2 mm) 组成, 铂金/二甲苯绝缘线屏蔽在硅胶管中 (图 5)。 将牵引器工具放在切口中, 重新进入球囊。 将电极阵列插入圆形窗口 (scala tympani), 其深度为第4白金环位于圆形窗口内。这给出了约2毫米的插入深度, 对应于在 ~ 30 khz16处的耳蜗内位置。 将引线卷在球囊内, 并将导线粘附到球囊上方的组织上。在整个实验过程中, 线圈线有助于保持阵列的位置。 小心地取出牵引器, 用纸巾关闭插入。 在颈部做一个小切口 (0.5 毫米), 垂直于活动电极和参考 abr 电极之间的线, 其中有组织剪刀。将铂金地球放入皮下口袋, 用组织胶关闭小切口 (图 6)。 将电极阵列板连接到动物刺激器平台。 7. 电动听觉脑干反应 (eabr) 请注意:动物刺激器平台 (asp) 用于电刺激电极阵列。可以使用其他电流源和软件系统。 将 abr 电极放置在以前的位置 (步骤2.3 至 2.5) (图 6)。 打开 asp 软件, 定义电脉冲刺激的范式。我们使用电荷平衡双相脉冲, 在每秒23.3 脉冲 (pps) 时呈现50μs 相和10μs 相间的相间相位间隙。电刺激是在电流水平不断提高的情况下, 在单极电极配置中传递的。目前每个级别的答复总数为400份。 通过 tdt 头级、前放大器和听觉处理器, 连续记录电脉冲序列, 记录诱发的 eabr 响应。 通过定制的 matlab 脚本绘制和分析 eabr 数据 (图 7)。补充文件中提供了录音的脚本和示例。 8. 实验结束 实验结束时, 根据机构指导方针对动物实施安乐死。 小心打开切口并取出植入物。 在蒸馏水中对电极阵列进行超声波化 10分钟, 以去除组织碎片。请注意:如果电极完好并具有适当的导电性, 植入物可以重复使用几次。要检查这一点, 测量电极的阻抗时, 一个万用表阵列是干的。 将电极阵列存放在干燥的地方。