بيولوجيا الخلية كمية من نيوروديجينيريشن في المورفولوجية من خلال تحليل غير منحازة للبروتينات فلوريسسينتلي المعلمة باستخدام إيماجيج
Summary
لقد قمنا بتطوير سير عمل بسيطة وقابلة للتكيف لاستخراج البيانات الكمية من دراسات بيولوجية الخلية المستندة إلى تصوير fluorescence تجميع البروتين والتمويه أوتوفاجيك في الجهاز العصبي المركزي لنماذج المورفولوجية نيوروديجينيريشن.
Abstract
مع تزايد انتشار أمراض الأعصاب، من المهم فهم الفيزيولوجيا المرضية الكامنة التي تؤدي إلى الخلل في الخلايا العصبية وفقدان. تكنولوجيات وأدوات التصوير القائم على الأسفار تمكين تحليل لم يسبق لها مثيل للعمليات العصبية الحيوية سوبسيلولار، ومع ذلك لا يزال هناك حاجة إلى اتباع نهج غير متحيز، واستنساخه، وموجودا لاستخراج البيانات القابلة للقياس الكمي من التصوير الدراسات . قمنا بتطوير سير عمل بسيطة وقابلة للتكيف لاستخراج البيانات الكمية من دراسات التصوير القائم على الأسفار باستخدام نماذج المورفولوجية نيوروديجينيريشن. على وجه التحديد، يمكننا وصف نهج شبه الآلي، وسهلة لمتابعة استخدام فيجي/إيماجيج لتحليل العمليات الخلوية هما: أولاً، نحن قياس محتوى البروتين الكلي والشخصية في الفص البصري المورفولوجية استخدام المسخ معلم فلوري البروتينات هونتينجتين؛ وثانيا، نقيم التمويه يحلول أوتوفاجي في نظام البصرية المورفولوجية الكمي على أساس راتيوميتريك لمراسل الفلورسنت جنبا إلى جنب مع أوتوفاجي. الأهم من ذلك، يتضمن البروتوكول الواردة هنا خطوة تقسيم شبه الآلي لضمان يتم تحليل جميع الهياكل الفلورية إلى أدنى حد تحيز الانتقاء وزيادة دقة مقارنات دقيقة. يمكن توسيع هذا النهج لتحليل الهياكل البيولوجية الأخرى الخلية وعمليات متورطين في نيوروديجينيريشن، مثل بونكتا البروتينية (حبيبات الإجهاد ومجمعات متشابك)، كذلك غشاء ربط الأجزاء الأخرى (الميتوكوندريا و غشاء الحويصلات الاتجار بالبشر). يوفر هذا الأسلوب الموحد، بعد إشارة قابلة للتكيف نقطة لتحليل الصور والقياس الكمي، ويمكن تيسير والموثوقية وإمكانية تكرار نتائج عبر الحقل، وفي نهاية المطاف تعزيز فهم الميكانيكية نيوروديجينيريشن.
Introduction
أمراض الأعصاب تؤثر على ملايين الناس كل عام، وهو تزايد حالات الإصابة شيخوخة سكان1. بينما كل مرض الأعصاب مسببات فريدة من نوعها، يتم تجميع البروتينات تجمعات وانهيار شبكة بروتيوستاسيس بصمات المرضية الشائعة لكثير من هذه الأمراض. توضيح كيفية تعطيل هذه العمليات المترابطة والأساسية تخفق لتسهم في وفاة الخلل والخلايا العصبية أمر بالغ الأهمية لفهم أمراض الأعصاب، فضلا عن توجيه التدخلات العلاجية. تصوير المستندة إلى الأسفار يسمح للتحقيق في هذه العمليات المعقدة والديناميكية في الخلايا العصبية، وقد ساهم إلى حد كبير في فهمنا لبيولوجيا الخلايا العصبية. تحليل البروتينات فلوريسسينتلي المعلمة يمثل تحديا، لا سيما عندما يتم إجراء التجارب في فيفو، سبب الأنسجة المدمجة عالية وأنواع الخلايا المختلفة وعدم تجانس الخصائص المورفولوجية. ساعد يدوياً التقدير الكمي هو بأسعار معقولة وواضحة، ولكن في كثير من الأحيان مضيعة للوقت وعرضه للتحيز البشري. ولذلك، هناك حاجة لنهج غير متحيز، واستنساخه، وموجودا لاستخراج البيانات القابلة للقياس الكمي من التصوير الدراسات.
وقد اوجزنا سير عمل بسيطة وقابلة للتكيف باستخدام فيجي/إيماجيج، صورة قوية، ويمكن الوصول إليها بحرية تجهيز البرمجيات2،3، لاستخراج البيانات الكمية من دراسات التصوير fluorescence في نماذج تجريبية من نيوروديجينيريشن استخدام المورفولوجية. باتباع هذا البروتوكول التحديد الكمي لتجميع البروتين والتمويه أوتوفاجيك – هما الخلية السمات البيولوجية التي ذات صلة وثيقة بعلم الأمراض مرض الأعصاب-أظهرنا حساسية وإمكانية تكرار نتائج هذا النهج. وكشف تحليل البروتينات هونتينجتين متحولة المعلمة فلوريسسينتلي (Htt) في الفص البصري المورفولوجية في عدد وحجم وكثافة المجاميع البروتين. يمكننا تصور مراسل فلورسنت جنبا إلى جنب للتمويه أوتوفاجيك داخل النظام المرئي المورفولوجية ، الذي يعرض إشارات الانبعاثات المختلفة تبعاً للبيئة يغلب4. التحليل القائم على راتيوميتريك للمراسل جنبا إلى جنب يسمح لطريقة عرض الكمية وشاملة للتمويه يحلول أوتوفاجي من تشكيل أوتوفاجوسومي، والنضج، والنقل إلى تدهور في يحلول، وأبرز بالإضافة إلى ذلك ضعفا المقصورات تعطلت في ظروف الأعصاب. الأهم من ذلك، في كل التحليلات نفذنا خطوات العتبة وتجزئة شبه الآلي لدينا بروتوكول للتقليل من التحيز فاقداً للوعي وزيادة قوة أخذ العينات وتقدم معياراً تيسير إجراء المقارنات بين دراسات مماثلة. سير العمل مباشرة يهدف إلى جعل قوية الإضافات فيجي/إيماجيج (وضعها علماء الكمبيوتر على أساس خوارزميات الرياضيات) أكثر يسرا نيوروبيولوجيستس والمجتمع علوم الحياة بصفة عامة.
Protocol
Representative Results
Discussion
يمكن استخدام البروتوكول الواردة هنا قوة وتكاثر كوانتيتاتي خلية العمليات البيولوجية التي تصور بتصوير المستندة إلى الأسفار. السياق البيولوجي والقيود التقنية بحاجة إلى النظر بعناية لتوجيه تصميم تجريبي. علامات مضيئة من هياكل سوبسيلولار للفائدة، سواء المناعي، صبغي، أو أعرب وراثيا، بحاجة إ?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
هذا العمل تدعمه شيلا، وديفيد فوينتي الأعصاب الألم برنامج الدراسات العليا زمالة بحثية (إلى J.M.B.)، وبرنامج الزملاء حياة البابا لويس (للبنود و Y.Z. و J.M.B.)، “زمالة مؤسسة” سنايدر-روبنسون بريدوكتورال (للبنود)، تي جون د. . مؤسسة ماكدونالد (للبنود)، العقود، منح من المعاهد الوطنية للصحة (المعاهد الوطنية للصحة) HHSN268201300038C و R21GM119018 و R56NS095893 (R.G.Z.)، ومشروع الباحث تايشان (مقاطعة شاندونغ، جمهورية الصين الشعبية) (إلى R.G.Z.).
Materials
| SYLGARD(R) 184 Silicone Elastomer Kit | Dow Corning Corporation | PF184250 | Dissection dish |
| Falcon 35 mm Not TC-Treated Easy-Grip Style Bacteriological Petri Dish | Corning | 351008 | Dissection dish |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11251-20 | Dissection tool |
| Sodium Chloride | Sigma | S3014 | PBS solution |
| Sodium Phosphate Dibasic | Sigma | S5136 | PBS solution |
| Potassium Phosphate Monobasic | Sigma | P5655 | PBS solution |
| Triton X-100 | Sigma | T9284 | Washing and antibody incubaton solution. |
| 37% Formaldehyde | VWR | 10790-710 | Fixation |
| Disposable Microcentrifuge Tubes (0.5mL, blue) | VWR | 89000-022 | Fixation, washing, and antibody incubaton. |
| Plain and Frosted Micro Slides (25×75mm) | VWR | 48312-004 | Slides for confocal imaging |
| Micro Cover Glasses, rectangular (22×40mm) | VWR | 48393-172 | Slides for confocal imaging |
| Rubber Cement | Slime | 1051-A | Mounting |
| VECTASHIELD Antifade Mounting Medium | Vector Laboratories, Inc. | H-1000 | Mounting |
| Scotch Magic 810 Invisible Tape (19mm×25.4m) | 3M Company | 810 | Mounting |
| Normal Goat Serum | Thermo Fisher Scientific | PCN5000 | Antibody incubaton |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | Thermo Fisher Scientific | D1306 | Nucleic acid staining. Dissolve in deionized water to make a 5 mg/mL stock solution and store at -80°C. Dilute to a working concentration of 10-20 μg/mL in PBTx. |
| 3.5X-90X Stereo Zoom Inspection Industrial Microscope | AmScope | SM-1BNZ | Dissection scope. Equipped with 6W LED Dual Gooseneck Illuminator |
| ImageJ/Fiji | NIH | v1.51u | With SCF_MPI_CBG plugins (version 1.1.2) |
| FV1000-IX81 Confocal-laser Scanning Microscope | Olympus | ||
| Recombinant Construct | Bloomington Drosophila Stock Center | BL37749 |
Riferimenti
- Erkkinen, M. G., Kim, M. -. O., Geschwind, M. D. Clinical Neurology and Epidemiology of the Major Neurodegenerative Diseases. Cold Spring Harbor perspectives in biology. , a033118 (2017).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature methods. 9 (7), 671 (2012).
- Mauvezin, C., Ayala, C., Braden, C. R., Kim, J., Neufeld, T. P. Assays to monitor autophagy in Drosophila. Methods. 68 (1), 134-139 (2014).
- Weiss, K. R., Kimura, Y., Lee, W. -. C. M., Littleton, J. T. Huntingtin aggregation kinetics and their pathological role in a Drosophila Huntington’s disease model. Genetica. 190 (2), 581-600 (2012).
- Babcock, D. T., Ganetzky, B. Transcellular spreading of huntingtin aggregates in the Drosophila brain. Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (39), E5427-E5433 (2015).
- DeVorkin, L., Gorski, S. M. Monitoring autophagy in Drosophila using fluorescent reporters in the UAS-GAL4 system. Cold Spring Harbor Protocols. 2014 (9), (2014).
- Williamson, W. R., Hiesinger, P. R. Preparation of developing and adult Drosophila brains and retinae for live imaging. Journal of visualized experiments: JoVE. (37), (2010).
- Sweeney, S. T., Hidalgo, A., de Belle, J. S., Keshishian, H. Dissection of adult Drosophila brains. Cold Spring Harbor Protocols. (12), (2011).
- Fox, C. H., Johnson, F. B., Whiting, J., Roller, P. P. Formaldehyde fixation. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 33 (8), 845-853 (1985).
- Lee, T., Luo, L. Mosaic analysis with a repressible cell marker (MARCM) for Drosophila neural development. Trends in neurosciences. 24 (5), 251-254 (2001).
- Fischbach, K. -. F., Dittrich, A. The optic lobe of Drosophila melanogaster. I. A Golgi analysis of wild-type structure. Cell and tissue research. 258 (3), 441-475 (1989).
- Ruan, K., Zhu, Y., Li, C., Brazill, J. M., Zhai, R. G. Alternative splicing of Drosophila Nmnat functions as a switch to enhance neuroprotection under stress. Nature Communications. 6, 10057 (2015).
- Zhai, R. G., et al. NAD synthase NMNAT acts as a chaperone to protect against neurodegeneration. Nature. 452 (7189), 887 (2008).
- Li, C., et al. Spermine synthase deficiency causes lysosomal dysfunction and oxidative stress in models of Snyder-Robinson syndrome. Nat Commun. 8 (1), 1257 (2017).
- Prokop, A., Meinertzhagen, I. A. Development and structure of synaptic contacts in Drosophila. Semin Cell Dev Biol. 17 (1), 20-30 (2006).
- Maday, S., Holzbaur, E. L. Autophagosome biogenesis in primary neurons follows an ordered and spatially regulated pathway. Dev Cell. 30 (1), 71-85 (2014).
- Mizushima, N., Yamamoto, A., Matsui, M., Yoshimori, T., Ohsumi, Y. In vivo analysis of autophagy in response to nutrient starvation using transgenic mice expressing a fluorescent autophagosome marker. Molecular biology of the cell. 15 (3), 1101-1111 (2004).
- Lee, S., Sato, Y., Nixon, R. A. Primary lysosomal dysfunction causes cargo-specific deficits of axonal transport leading to Alzheimer-like neuritic dystrophy. Autophagy. 7 (12), 1562-1563 (2011).
- Vincent, L., Soille, P. Watersheds in digital spaces: an efficient algorithm based on immersion simulations. IEEE Transactions on Pattern Analysis & Machine Intelligence. (6), 583-598 (1991).
- Najman, L., Schmitt, M. Geodesic saliency of watershed contours and hierarchical segmentation. IEEE Transactions on pattern analysis and machine intelligence. 18 (12), 1163-1173 (1996).
- Shiber, A., Breuer, W., Ravid, T. Flow cytometric quantification and characterization of intracellular protein aggregates in yeast. Prion. 8 (3), 276-284 (2014).
- Mizushima, N., Yoshimori, T., Levine, B. Methods in mammalian autophagy research. Cell. 140 (3), 313-326 (2010).
