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Biologia dello sviluppo

Microcircuito sináptica modelado con 3D Cocultures de astrocitos y neuronas de células madre pluripotentes humanas

Published: August 16, 2018
doi:
10.3791/58034
, ,
1Center for Neuroregeneration, Department of Neurosurgery,Houston Methodist Research Institute

Summary

En este protocolo, nuestro objetivo es describir un método reproducible para combinar disociado humanas pluripotentes células madre derivadas neuronas y astrocitos juntos en 3D esfera cocultures, mantener estas esferas en condiciones flotantes libres y posteriormente medición de la actividad de circuito sináptico de las esferas con inmunoanálisis y matriz micropozo-microcanal grabaciones.

Abstract

Una barrera para nuestra comprensión de cómo varios tipos de células y señales contribuyen a la función sináptica del circuito es la falta de modelos relevantes para el estudio del cerebro humano. Una tecnología emergente para abordar este tema es el uso de tres dimensiones (3D) nervios cultivos de células, denominado ‘organoides’ o esferoides, para la preservación a largo plazo de las interacciones intercelulares como moléculas de adhesión extracelular. Sin embargo, estos sistemas de cultivo son mucho tiempo y no sistemáticamente generado. Aquí detallamos un método rápidamente y consistentemente producir cocultures 3D de neuronas y astrocitos de humanas pluripotentes células madre. Astrocitos en primer lugar, el distinguido y trasplante de precursores neuronales es disociados y contado. A continuación, las células se combinan en forma de esfera platos con un inhibidor de la Rho-quinasa y en proporciones específicas para producir esferas de tamaño reproducible. Después de varias semanas de la cultura como esferas flotantes, cocultures (‘asteroides’) finalmente se secciona para la inmunotinción o plateados sobre matrices micropozo-microcanal para medir la fuerza y la densidad sináptica. En general, se espera que este protocolo dará 3D esferas neurales que mostrar marcadores del tipo de célula madura restringido, forman sinapsis funcionales y exhiben red sináptica espontánea explosión actividad. Juntos, este sistema permite detección de drogas y las investigaciones sobre los mecanismos de la enfermedad en un modelo más conveniente en comparación con cultivos de monocapa.

Introduction

Los astrocitos son un tipo de célula glial muy abundante dentro de sistema nervioso central (SNC) con una variedad de responsabilidades funcionales más allá de la ayuda estructural. A través de la secreción de factores solubles sinaptogénica y componentes de la matriz extracelular (ECM), astrocitos ayudan en el establecimiento y agrupación de sinapsis Maduritas durante desarrollo1. También juegan un papel crítico en el mantenimiento de la salud y plasticidad de las sinapsis a través de señalización extracelular2,3,4,5y contribuir a la estabilidad a largo plazo de homeostático ambientes mediante la regulación de potasio extracelular y glutamato, así como la secreción de sustratos de energía y ATP6,7,8. Finalmente, puede contribuir a la neurotransmisión por influir en las corrientes extrasinápticos9e indirectamente puede influir en la actividad a través de otros tipos celulares como la promoción de myelination10. Importante, debido a anomalía o disfunción de los astrocitos puede conducir a muchos síndromes del desarrollo neurológico y neuropatología adulto, es evidente la necesidad de incluir astrocitos junto a las neuronas en redes neuronales Ingeniería en orden para un mejor modelo del ambiente endógeno del cerebro. Una característica integral de astrocitos es su capacidad de interacciones dinámicas forma sinapsis neuronal1,11,12. En la ausencia de glia, las neuronas forman un número limitado de las sinapsis, que en general carecen de madurez funcional13.

Los astrocitos humanos Mostrar características morfológicas, transcripcionales y funcionales — tales como aumento en el tamaño y la complejidad de la ramificación, así como sobre los genes — que no son recapitulados en roedores12,14, 15. Como resultado, los estudios utilizando la célula de vástago de pluripotent humanas (hPSC)-células neuronales derivadas han aceptado ampliamente como un medio de examinar enfermedades relacionadas con el CNS en vitro en el desarrollo de nuevas terapias, lesiones modelos y paradigmas de la cultura16 ,17. Además, hPSCs permiten el estudio de la formación de la sinapsis humana y función sin necesidad de tejido primario18,19.

Una barrera para nuestra comprensión de cómo varios tipos de células y señales contribuyen a la función sináptica del circuito es la falta de modelos relevantes del cerebro humano. Hay una necesidad de una plataforma adecuada recapitular sus redes sinápticas con alta fidelidad y reproducibilidad. Recientemente, ha surgido interés en la producción de sistemas de cultivo 3D (ampliamente conocido como ‘organoides,’ ‘esferoides’, o ‘mini cerebros’)20 de modelo complejo tridimensional (3D) las estructuras a nivel celular y macro. Sistemas de cultivo 3D mantienen interacciones célula-célula y ECM que son normalmente ausente o limitada en cocultivo 2D típico paradigmas21,22. Existen una gran cantidad de técnicas para el cultivo de esferoides nervios 3D23,24,25; sin embargo, muchos requieren períodos de cultivo prolongado (meses a años) de desarrollo espontáneo y preservación de la capa, con el usuario exhibiendo muy poco control sobre la salida.

Aquí, nos ilustran un método sistemático para rápidamente y constantemente bioingeniero interacciones neuronales entre múltiples tipos de células (previamente diferenciadas neuronas y astrocitos) derivan de hPSCs por Unión de células en cocultures de la esfera (asteroides)26 que recapitulan las complejidades morfológicas específicas de humanos en 3D. Este sistema neuronal alta densidad genera subtipos neuronales dispersos uniformemente que tomar propiedades madura con el tiempo y pueden ser proyectados o analizados de un modo de alto rendimiento. Demostramos por primera vez que los astrocitos humanos inducen la actividad de explosión sináptica red en estos cocultures 3D. Además, este protocolo es fácilmente adaptable para generar esferas de diferentes tamaños, para utilizar células especificadas para diferentes identidades regionales de la CNS y estudiar las interacciones de varios otros tipos celulares como se desee.

Protocol

1. cultura y preparación de los reactivos de la célula Nota: Los protocolos en esta sección se escriben en el orden en que aparecen en el protocolo de diferenciación (sección 2). Vea la Tabla de materiales para materiales y números de catálogo. Preparar placas cubiertas para el cultivo celular. Solución de capa de matriz extracelular (ECM) con medio DMEM/F12 prepare un 1 mg/mL solución diluida. Alícuota ECM diluido solución de s…

Representative Results

Cuando se realiza correctamente, este protocolo produce poblaciones definidas de cocultures funcionales de astrocitos28,33,34 y neuronas35 generados a partir de hPSCs (figura 1A-1C), como detallado anteriormente26 y aquí descritos en los pasos 2.1, 2.2. Este procedimiento paso a paso, con la utilizaci?…

Discussion

En este protocolo, se describe un método sistemático para la producción de esferas 3D de nervios cocultures. Las esferas están compuestos por astrocitos y neuronas, que se derivan independientemente de hPSCs. Aunque no es el objetivo de este protocolo, la generación de poblaciones puras de astrocitos del hPSCs28 es un paso crítico y puede ser técnicamente difícil si se realiza sin experiencia previa. Este primer paso en la generación de estos microcircuitos sinápticas debe realizarse con…

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Nos gustaría agradecer a Dr. Erik Ullian (UCSF) por entrada intelectual sobre el diseño de estos procedimientos, el Dr. Michael Ward (NIH) para asesoramiento técnico en la diferenciación iNeuron y Barlas de Saba para el análisis preliminar de la imagen.

Materials

6 well plate Fisher Scientific 08-772-1B
15 ml conical tubes Olympus Plastics 28-101
Accutase Sigma A6964-100ML Detachment solution
AggreWell plate Stemcell Technologies 34850
Anti-Adherence Rinsing Solution Stemcell Technologies 7010 Prevent cell adhesion to microwell plates
Anti/anti Thermofisher 15240062
B27 Thermofisher 17504044 Media Supplement
BrainPhys neuronal medium Stemcell Technologies 5790 Neurophysiological basal medium alternative
Circular glass coverslips Neuvitro GG-12-oz
Cryostor CS10 Stemcell Technologies 7930 Cryopreservation medium with 10% DMSO
DMEM/F12 Thermofisher 10565-042 With GlutaMAX supplement
DMH-1 Stemcell Technologies 73634 HAZARD: Toxic if swallowed. Working concentration: 2 uM
Donkey serum Lampire Biological Laboratories 7332100 Working concentration: 5% in primary blocking buffer, 1% in secondary blocking buffer
Doxycycline Hydrochloride (Dox) Sigma D3072-1ml HAZARD: Toxic for pregnant women. Working concentration: 2 ug/mL
Epidermal growth factor (EGF) Peprotech AF-100-15 Working concentration: 10 ng/mL
Fibroblast growth factor-2 (FGF) Peprotech 100-18B Working concentration: 10 ng/mL
Fluoromount-G mounting solution Southern Biotech 0100-01
Glass slides Fisherbrand 22-037-246
Goat serum Lampire Biological Laboratories 7332500 Working concentration: 5% in primary blocking buffer, 1% in secondary blocking buffer
Hemacytometer or automatic cell counter Life Technologies AMQAX1000
Heparin Sigma H3149-50KU Working concentration: 2 mg/mL
Magnetic plate DLAB 8030170200
Matrigel membrane matrix Corning 354230 ECM coating solution. Working concentration: 80 ug/ml. Prepare on ice and ensure that pipettes, tubes, and media are pre-chilled.
MEA 2100 System Multichannel Systems MEA2100
Mounting solution
N2 Thermofisher 17502048 Media Supplement
OCT Tissue-Tek 4583 Tissue embedding solution for cryosectioning
Pap Pen (Aqua Hold) Scientific Device Laboratory 9804-02
Paraformaldehyde (PFA) Acros Organics 169650025 HAZARD: Toxic if inhaled. Working concentration: 4% in PBS
Phosphate buffered saline (PBS) Stemcell Technologies CA008-300
Poly-l-ornithine (PLO) Sigma P3655-100MG Working concentration: 0.5 mg/mL
Rectangular glass cover slips Fisherfinest Premium Superslip 12-545-88
ReLeSR Stemcell Technologies 5872 Detachment and passaging reagent
Rho-Kinase Inhibitor Y27632- (Y) Tocris 1254 Working concentration: 10 uM
SB431542 Stemcell Technologies 72234 Working concentration: 2 uM
Spinner flasks Fisher Scientific 4500-125
Sucrose Fisher Chemical S5-3 Working concentration: 20% or 30% in PBS
T25 Culture Flask Olympus Plastics 25-207 Vented caps
T75 Culture Flask Olympus Plastics 25-209 Vented caps
Terg-A-zyme Sigma Z273287-1EA Detergent. Working concentration: 1%
TeSR-E8 basal medium Stemcell Technologies 5940 Human pluripotent stem cell (hPSC) medium
TeSR-E8 supplements Stemcell Technologies 5940 Supplements for human pluripotent stem cell medium
TritonX-100 Sigma X100-500ML Detergent for cell permeabilization. Working concentration: 0.25% in blocking buffer
Trypan blue Invitrogen T10282
Antibodies
AlexaFluor 488 Thermofisher A-11029 Secondary antibody
AlexaFluor 594 Thermofisher A-11037 Secondary antibody
Ezrin Thermofisher MA5-13862 Primary antibody; astrocytes perisynaptic
GFAP Chemicon MAB360 Primary antibody; astrocytes
GFP Aves GFP-1020 Primary antibody; astrocytes
Glt1 Gift from Dr. Jeffrey Rothstein n/a Primary antibody; astrocytes
Homer Synaptic Systems 160 011 Primary antibody; neurons, post-synaptic
MAP2 Synaptic Systems 188 004 Primary antibody; neurons
PSD95 Abcam ab2723 Primary antibody; neurons, post-synaptic
S100 Abcam ab868 Primary antibody; astrocytes
Synapsin 1 Synaptic Systems 106 103 Primary antibody; neurons, pre-synaptic
TuJ1/β3-tubulin (TUBB3) Covance MMS-435P Primary antibody; neurons
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Riferimenti

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Cvetkovic, C., Basu, N., Krencik, R. Synaptic Microcircuit Modeling with 3D Cocultures of Astrocytes and Neurons from Human Pluripotent Stem Cells. J. Vis. Exp. (138), e58034, doi:10.3791/58034 (2018).
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