Моделирование синаптических микросхемы с 3D Cocultures астроциты и нейроны от человеческих плюрипотентных стволовых клеток
Summary
В этом протоколе мы стремимся, чтобы описать воспроизводимый метод для объединения отделить человеческих плюрипотентных стволовых клеток получены нейронов и астроциты вместе в 3D шар cocultures, поддержание этих сфер в Свободный плавающий условиях и впоследствии измерение активности синаптических цепи сфер с иммуноанализа и многоэлектродный массив записей.
Abstract
Барьер для нашего понимания того, как различные типы клеток и сигналы способствует синаптических цепи функции является отсутствие соответствующих моделей для изучения человеческого мозга. Одной из новых технологий для решения этой проблемы является использование три трехмерные (3D) Нейронные клеточных культур, называется «organoids» или «сфероидов», для долгосрочного сохранения включая молекулы внеклеточного адгезии межклеточных взаимодействий. Однако эти системы культуры, много времени и не систематически сгенерированный. Здесь мы подробно метод быстро и последовательно производить 3D cocultures нейронов и астроциты от человеческих плюрипотентных стволовых клеток. Во-первых, предварительно дифференцированной астроциты нейрональных прародителями отделить и рассчитывал. Далее, ячейки объединяются в сфере формирования блюда с Ро-киназы ингибитора и на конкретные показатели производить сферах воспроизводимость размеров. После нескольких недель культуры как плавающий сферы cocultures («астероиды») наконец секционного для иммуноокрашивания или покрытием на многоэлектродный массивы для измерения синаптических плотность и прочность. В целом ожидается, что этот протокол будет выход 3D нейронных сфер, которые отображают зрелых клеток тип ограничен маркеры, формируют функциональные синапсов и проявлять спонтанные синаптических сетевой всплеск активности. Вместе Эта система позволяет наркотиков скрининг и расследования механизмов болезни в более подходящие модели по сравнению с монослоя культур.
Introduction
Астроциты являются очень обильные глиальных клеток типа в пределах центральной нервной системы (ЦНС) с целым рядом функциональных обязанностей за пределами структурной поддержки. Через секрецию растворимых synaptogenic факторов и компонентов внеклеточного матрикса (ECM) астроциты помощи в создании и кластеризации зрелых синапсов во время развития1. Они также играют важную роль в поддержании здоровья и пластичности синапсов через внеклеточных сигналов2,3,4,5и способствуют долгосрочной стабильности гомеостаза среды, регулируя внеклеточного калия и глутамата, а также секрецию энергетических субстратов и СПС6,,78. Наконец они могут способствовать синапсах, воздействуя на внесинаптического течения9и может косвенно влиять на активность через другие типы клеток, таких как содействие миелинизации10. Что важно потому что аномалий или дисфункции астроциты может привести к много нервной синдромы и взрослых невропатология, существует очевидная необходимость включить астроциты наряду с нейронов в инженерии нейронных сетей в целях улучшения модели эндогенного мозга окружающей среды. Астроциты является неотъемлемой характеристикой является их способность динамического взаимодействия формы с нейрональных синапсах1,,1112. В отсутствие глии нейроны образуют ограниченное количество синапсов, которые в целом также не хватает функциональной зрелости13.
Человека астроциты морфологических, транскрипционный анализ и функциональные характеристики отображения — например увеличение размера и сложности ветвления, а также вегетационных генов — что не изъятый в грызунов12,14, 15. В результате исследования использования человеческих плюрипотентных стволовых клеток (hPSC)-производных нервные клетки получили широкое признание как средство изучения заболеваний ЦНС в пробирке при разработке Роман терапии, травмы модели и культура парадигмы16 ,17. Кроме того hPSCs разрешения на изучение человека синапса формирования и функции без необходимости в основной ткани18,19.
Барьер для нашего понимания того, как различные типы клеток и сигналы способствует синаптических цепи функции является отсутствие соответствующих моделей человеческого мозга. Существует необходимость для соответствующей платформы для резюмировать его синаптических сетей с высокой точностью и воспроизводимостью. Недавно, интерес возник в производстве систем 3D культуры (широко известный как «organoids», «сфероидов», или «мини-мозги»)20 для моделирования сложных трехмерных (3D) структур на сотовые и макро уровнях. 3D культуры систем сохраняют ECM и ячеек взаимодействия, которые обычно отсутствуют или ограниченные во время типичного 2D coculture парадигмы21,22. Обилие методы существуют для культивирования 3D нейронных сфероидов23,24,25; Однако, многие требуют длительных культуры периодов (месяцев до лет) для спонтанного развития и сохранения слоя, с пользователем выставке очень мало контроля над выходных данных.
Здесь мы иллюстрируем систематический способ быстро и последовательно биоинженер Нейронные взаимодействия среди нескольких типов клеток (предварительно дифференцированной нейронов и астроциты) полученных от hPSCs путем сборки клеток в сфере cocultures («астероиды»)26 , пилки морфологических сложности конкретного человека в 3D. Этой высокой плотности нервная система генерирует равномерно рассеяны нейронных подтипы, которые взять на зрелых свойств с течением времени и может быть показан или assayed в духе высокой пропускной способности. Мы показываем, в первый раз, что человека астроциты побудить синаптических сетевой всплеск активности в этих 3D cocultures. Кроме того этот протокол является легко адаптируется для создания сферы разных размеров, использовать клетки, указанный для различных региональных тождества ЦНС и для изучения взаимодействия нескольких других типов клеток по желанию.
Protocol
Representative Results
Discussion
В этом протоколе мы описываем систематический метод для производства 3D сфер нейронные cocultures. Сферах состоят из астроцитов и нейроны, которые являются производными независимо от hPSCs. Хотя не в центре внимания настоящего Протокола, поколение чистого популяций астроциты hPSCs28…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы хотели бы поблагодарить д-р Эрик Ullian (UCSF) за интеллектуальный вклад в разработке этих процедур, д-р Майкл Уорд (НИЗ) для технических консультаций по iNeuron дифференциация и Саба Барлас для анализа предварительных изображений.
Materials
| 6 well plate | Fisher Scientific | 08-772-1B | |
| 15 ml conical tubes | Olympus Plastics | 28-101 | |
| Accutase | Sigma | A6964-100ML | Detachment solution |
| AggreWell plate | Stemcell Technologies | 34850 | |
| Anti-Adherence Rinsing Solution | Stemcell Technologies | 7010 | Prevent cell adhesion to microwell plates |
| Anti/anti | Thermofisher | 15240062 | |
| B27 | Thermofisher | 17504044 | Media Supplement |
| BrainPhys neuronal medium | Stemcell Technologies | 5790 | Neurophysiological basal medium alternative |
| Circular glass coverslips | Neuvitro | GG-12-oz | |
| Cryostor CS10 | Stemcell Technologies | 7930 | Cryopreservation medium with 10% DMSO |
| DMEM/F12 | Thermofisher | 10565-042 | With GlutaMAX supplement |
| DMH-1 | Stemcell Technologies | 73634 | HAZARD: Toxic if swallowed. Working concentration: 2 uM |
| Donkey serum | Lampire Biological Laboratories | 7332100 | Working concentration: 5% in primary blocking buffer, 1% in secondary blocking buffer |
| Doxycycline Hydrochloride (Dox) | Sigma | D3072-1ml | HAZARD: Toxic for pregnant women. Working concentration: 2 ug/mL |
| Epidermal growth factor (EGF) | Peprotech | AF-100-15 | Working concentration: 10 ng/mL |
| Fibroblast growth factor-2 (FGF) | Peprotech | 100-18B | Working concentration: 10 ng/mL |
| Fluoromount-G mounting solution | Southern Biotech | 0100-01 | |
| Glass slides | Fisherbrand | 22-037-246 | |
| Goat serum | Lampire Biological Laboratories | 7332500 | Working concentration: 5% in primary blocking buffer, 1% in secondary blocking buffer |
| Hemacytometer or automatic cell counter | Life Technologies | AMQAX1000 | |
| Heparin | Sigma | H3149-50KU | Working concentration: 2 mg/mL |
| Magnetic plate | DLAB | 8030170200 | |
| Matrigel membrane matrix | Corning | 354230 | ECM coating solution. Working concentration: 80 ug/ml. Prepare on ice and ensure that pipettes, tubes, and media are pre-chilled. |
| MEA 2100 System | Multichannel Systems | MEA2100 | |
| Mounting solution | |||
| N2 | Thermofisher | 17502048 | Media Supplement |
| OCT | Tissue-Tek | 4583 | Tissue embedding solution for cryosectioning |
| Pap Pen (Aqua Hold) | Scientific Device Laboratory | 9804-02 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Acros Organics | 169650025 | HAZARD: Toxic if inhaled. Working concentration: 4% in PBS |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Stemcell Technologies | CA008-300 | |
| Poly-l-ornithine (PLO) | Sigma | P3655-100MG | Working concentration: 0.5 mg/mL |
| Rectangular glass cover slips | Fisherfinest Premium Superslip | 12-545-88 | |
| ReLeSR | Stemcell Technologies | 5872 | Detachment and passaging reagent |
| Rho-Kinase Inhibitor Y27632- (Y) | Tocris | 1254 | Working concentration: 10 uM |
| SB431542 | Stemcell Technologies | 72234 | Working concentration: 2 uM |
| Spinner flasks | Fisher Scientific | 4500-125 | |
| Sucrose | Fisher Chemical | S5-3 | Working concentration: 20% or 30% in PBS |
| T25 Culture Flask | Olympus Plastics | 25-207 | Vented caps |
| T75 Culture Flask | Olympus Plastics | 25-209 | Vented caps |
| Terg-A-zyme | Sigma | Z273287-1EA | Detergent. Working concentration: 1% |
| TeSR-E8 basal medium | Stemcell Technologies | 5940 | Human pluripotent stem cell (hPSC) medium |
| TeSR-E8 supplements | Stemcell Technologies | 5940 | Supplements for human pluripotent stem cell medium |
| TritonX-100 | Sigma | X100-500ML | Detergent for cell permeabilization. Working concentration: 0.25% in blocking buffer |
| Trypan blue | Invitrogen | T10282 | |
| Antibodies | |||
| AlexaFluor 488 | Thermofisher | A-11029 | Secondary antibody |
| AlexaFluor 594 | Thermofisher | A-11037 | Secondary antibody |
| Ezrin | Thermofisher | MA5-13862 | Primary antibody; astrocytes perisynaptic |
| GFAP | Chemicon | MAB360 | Primary antibody; astrocytes |
| GFP | Aves | GFP-1020 | Primary antibody; astrocytes |
| Glt1 | Gift from Dr. Jeffrey Rothstein | n/a | Primary antibody; astrocytes |
| Homer | Synaptic Systems | 160 011 | Primary antibody; neurons, post-synaptic |
| MAP2 | Synaptic Systems | 188 004 | Primary antibody; neurons |
| PSD95 | Abcam | ab2723 | Primary antibody; neurons, post-synaptic |
| S100 | Abcam | ab868 | Primary antibody; astrocytes |
| Synapsin 1 | Synaptic Systems | 106 103 | Primary antibody; neurons, pre-synaptic |
| TuJ1/β3-tubulin (TUBB3) | Covance | MMS-435P | Primary antibody; neurons |
Riferimenti
- Ullian, E. M., Christopherson, K. S., Barres, B. A. Role for Glia in Synaptogenesis. Glia. 47, 209-216 (2004).
- Baldwin, K. T., Eroglu, C. Molecular mechanisms of astrocyte-induced synaptogenesis. Current Opinion in Neurobiology. 45, 113-120 (2017).
- Molofsky, A. V., et al. Astrocyte-encoded positional cues maintain sensorimotor circuit integrity. Nature. 509 (7499), 189-194 (2014).
- Sultan, S., et al. Synaptic Integration of Adult-Born Hippocampal Neurons Is Locally Controlled by Astrocytes. Neuron. 88, 957-972 (2015).
- Clarke, L. E., Barres, B. A. Emerging roles of astrocytes in neural circuit development. Nat Rev Neuroscience. 14 (5), 311-321 (2013).
- Cheung, G., Sibille, J., Zapata, J., Rouach, N. Activity-Dependent Plasticity of Astroglial Potassium and Glutamate Clearance. Neural Plasticity. , 109106 (2015).
- Ghezali, G., Dallerac, G., Rouach, N. Perisynaptic astroglial processes dynamic processors of neuronal information. Brain Struct Funct. 221, 2427-2442 (2016).
- Kimelberg, H. K., Nedergaard, M. Functions of Astrocytes and their Potential As Therapeutic Targets. Neurotherapeutics. 7, 338-353 (2010).
- Pál, B. Astrocytic Actions on Extrasynaptic Neuronal Currents. Frontiers in Cellular Neuroscience. 9, 474 (2015).
- Kiray, H., Lindsay, S. L., Hosseinzadeh, S., Barnett, S. C. The multifaceted role of astrocytes in regulating myelination. Experimental Neurology. 283, 541-549 (2016).
- Allen, N. J., Eroglu, C. Cell Biology of Astrocyte-Synapse Interactions. Neuron. 96 (3), 697-708 (2017).
- Krencik, R., van Asperen, J. V., Ullian, E. M. Human astrocytes are distinct contributors to the complexity of synaptic function. Brain Research Bulletin. 129, 66-73 (2017).
- Ullian, E. M., Sapperstein, S. K., Christopherson, K. S., Barres, B. A. Control of Synapse Number by Glia. Science. 291, 657-662 (2001).
- Oberheim Bush, N. A., Nedergaard, M. Do Evolutionary Changes in Astrocytes Contribute to the Computational Power of the Hominid Brain?. Neurochemical Research. 42 (9), 2577-2587 (2017).
- Han, X., et al. Forebrain Engraftment by Human Glial Progenitor Cells Enhances Synaptic Plasticity and Learning in Adult Mice. Cell Stem Cell. 12 (3), 342-353 (2013).
- Inoue, H., Nagata, N., Kurokawa, H., Yamanaka, S. iPS cells: a game changer for future medicine. The EMBO Journal. 33 (5), 409-417 (2014).
- Shi, Y., Inoue, H., Wu, J. C., Yamanaka, S. Induced pluripotent stem cell technology a decade of progress. Nature Reviews Drug Discovery. 16 (2), 115-130 (2017).
- Dodla, M. C., Mumaw, J., Stice, S. L. Role of astrocytes, soluble factors, cells adhesion molecules and neurotrophins in functional synapse formation: implications for human embryonic stem cell derived neurons. Stem Cell Res Ther. , 251-260 (2010).
- Krencik, R., Ullian, E. M. A cellular star atlas: using astrocytes from human pluripotent stem cells for disease studies. Frontiers in Cellular Neuroscience. 7, 1-10 (2013).
- Pasca, S. P. The rise of three-dimensional human brain cultures. Nature. 553 (7689), 437-445 (2018).
- Huch, M., Knoblich, J. A., Lutolf, M. P., Martinez-arias, A. The hope and the hype of organoid research. Development. 144, 938-941 (2017).
- Mason, J. O., Price, D. J. Building Brains in a Dish: Prospects for Growing Cerebral Organoids from Stem Cells. Neuroscienze. 334, 105-118 (2016).
- Kelava, I., Lancaster, M. A. Dishing out mini-brains: Current progress and future prospects in brain organoid research. Biologia dello sviluppo. 420 (2), 199-209 (2016).
- Kelava, I., Lancaster, M. A. Stem Cell Models of Human Brain Development. Cell Stem Cell. 18 (6), 736-748 (2016).
- Sloan, S. A., et al. Human Astrocyte Maturation Captured in 3D Cerebral Cortical Spheroids Derived from Pluripotent Stem Cells. Neuron. , 779-790 (2017).
- Krencik, R., et al. Systematic three-dimensional coculture rapidly recapitulates interactions between human neurons and astrocytes. Stem Cell Reports. 9 (6), 1745-1753 (2017).
- Chen, G., et al. Chemically defined conditions for human iPSC derivation and culture. Nature Methods. 8 (5), 424-429 (2011).
- Krencik, R., Zhang, S. -. C. Directed differentiation of functional astroglial subtypes from human pluripotent stem cells. Nature Protocols. 6 (11), 1710-1717 (2011).
- Du, Z. -. W., et al. Generation and expansion of highly pure motor neuron progenitors from human pluripotent stem cells. Nature Communications. 6, 6626 (2015).
- Neely, M. D., et al. DMH1, a highly selective small molecule BMP inhibitor promotes neurogenesis of hiPSCs: Comparison of PAX6 and SOX1 expression during neural induction. ACS Chemical Neuroscience. 3 (6), 482-491 (2012).
- Lippmann, E. S., Estevez-Silva, M. C., Ashton, R. S. Defined Human Pluripotent Stem Cell Culture Enables Highly Efficient Neuroepithelium Derivation Without Small Molecule Inhibitors. Stem Cells. 32, 1032-1042 (2014).
- Eggan, K., Kawada, J., Kaneda, S., Kirihara, T., Maroof, A. Generation of a Motor Nerve Organoid with Human Stem Cell-Derived Neurons. Stem Cell Reports. 9, 1441-1449 (2017).
- Krencik, R., Weick, J. P., Liu, Y., Zhang, Z. -. J., Zhang, S. -. C. Specification of transplantable astroglial subtypes from human pluripotent stem cells. Nature Biotechnology. 29 (6), 528-534 (2011).
- Krencik, R., et al. Dysregulation of astrocyte extracellular signaling in Costello syndrome. Science Translational Medicine. 7 (286), 286 (2015).
- Wang, C., et al. Scalable Production of iPSC-Derived Human Neurons to Identify Tau- Lowering Compounds by High-Content Screening. Stem Cell Reports. 9 (4), 1221-1233 (2017).
- Amin, H., Maccione, A., Marinaro, F., Zordan, S., Nieus, T., Berdondini, L. Electrical Responses and Spontaneous Activity of Human iPS-Derived Neuronal Networks Characterized for 3-month Culture with 4096-Electrode Arrays. Frontiers in Neuroscience. 10, (2016).
- Kapucu, F. E., Mäkinen, M. E., Tanskanen, J. M. A., Ylä-Outinen, L., Narkilahti, S., Hyttinen, J. A. K. Joint analysis of extracellular spike waveforms and neuronal network bursts. Journal of Neuroscience Methods. 259, 143-155 (2016).
- Ippolito, D. M., Eroglu, C. Quantifying Synapses: an Immunocytochemistry-based Assay to Quantify Synapse Number. Journal of Visualized Experiments. 45, 2-9 (2010).
- Zhang, Y., et al. Rapid single-step induction of functional neurons from human pluripotent stem cells. Neuron. 78 (5), 785-798 (2013).
- Odawara, A., Katoh, H., Matsuda, N., Suzuki, I. Physiological maturation and drug responses of human induced pluripotent stem cell-derived cortical neuronal networks in long-term culture. Scientific reports. 6, 26181 (2016).
- Bardy, C., Hurk, , et al. Neuronal medium that supports basic synaptic functions and activity of human neurons in vitro. PNAS. 112 (25), E2725-E2734 (2015).
- Monzel, A. S., et al. Derivation of Human Midbrain-Specific Organoids from Neuroepithelial Stem Cells. Stem Cell Reports. 8, 1144-1154 (2017).
- Lancaster, M. A., Knoblich, J. A. Generation of cerebral organoids from human pluripotent stem cells. Nature Protocols. 9 (10), 2329-2340 (2014).
- Dutta, D., Heo, I., Clevers, H. Disease Modeling in Stem Cell-Derived 3D Organoid Systems. Trends in Molecular Medicine. 23 (5), 393-410 (2018).
- Lancaster, M. A., et al. Cerebral organoids model human brain development and microcephaly. Nature. 501 (7647), 373-379 (2013).
- Qian, X., et al. Brain-Region-Specific Organoids Using Mini-bioreactors for Modeling ZIKV Exposure. Cell. 165 (5), 1238-1254 (2016).
- Yan, Y., et al. Derivation of Cortical Spheroids from Human Induced Pluripotent Stem Cells in a Suspension Bioreactor. Tissue Engineering Part A. , 1-46 (2016).
- Obien, M. E. J., Deligkaris, K., Bullmann, T., Bakkum, D. J., Frey, U. Revealing neuronal function through microelectrode array recordings. Frontiers in Neuroscience. 9 (JAN), 423 (2015).
- Hales, C. M., Rolston, J. D., Potter, S. M. How to Culture, Record and Stimulate Neuronal Networks on Micro-electrode Arrays (MEAs). Journal of Visualized Experiments. (39), 1-7 (2010).
- Shigetomi, E., Patel, S., Khakh, B. S. Probing the Complexities of Astrocyte Calcium Signaling. Trends in Cell Biology. 26 (4), 300-312 (2016).
- Bagley, J. A., Reumann, D., Bian, S., Lévi-strauss, J., Knoblich, J. A. Fused cerebral organoids model interactions between brain regions. Nat Methods. 14 (7), (2017).
