JoVE Journal > Developmental Biology
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Risultati
Discussion
Divulgazioni
Acknowledgements
Materials
Riferimenti
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Biologia dello sviluppo

Microcircuit סינפטית דוגמנות עם Cocultures 3D האסטרוציטים ו נוירונים מתאי גזע Pluripotent אנושי

Published: August 16, 2018
doi:
10.3791/58034
, ,
1Center for Neuroregeneration, Department of Neurosurgery,Houston Methodist Research Institute

Summary

פרוטוקול זה, אנו שואפים לתאר שיטה ישימה עבור שילוב הפומבית pluripotent אנושיים לתאי גזע נגזר נוירונים, האסטרוציטים יחד לתוך 3D כדור cocultures, שמירה על אלה התחומים בתנאים צף חינם, ולאחר מכן מדידת פעילות סינפטית מעגל הכדורים עם immunoanalysis והקלטות מערך multielectrode.

Abstract

מחסום ההבנה שלנו של מה סוגי תאים שונים אותות לתרום פונקציה מעגל סינפטית היא חוסר דגמים הרלוונטיים עבור הלומדים המוח האנושי. טכנולוגיות מתפתחות אחד כדי לטפל בבעיה זו הוא השימוש של שלוש התרבויות תאי העצבים (3D) תלת-ממדי, הנקרא ‘organoids’ או ‘spheroids’, לשם שימור לטווח ארוך של אינטראקציות המערכת כולל מולקולות אדהזיה חוץ-תאית. עם זאת, מערכות התרבות אלו הן זמן רב לא באופן שיטתי שנוצר. כאן, אנחנו פירוט שיטה לייצר במהירות ובאופן עקבי cocultures 3D של נוירונים, תאי גזע האסטרוציטים מ pluripotent אנושי. האסטרוציטים הראשון, הבדיל מראש, אבות עצביים הפומבית, ספרתי. בשלב הבא, תאים משולבים ב ויוצרים כדור מנות עם מעכב Rho-קינאז ועל יחסי מסוים כדי לייצר כדורים בגודל לשחזור. לאחר מספר שבועות של תרבות כמו כדורים צפים, cocultures (“אסטרואידים”) סוף סוף למחלקה עבור immunostaining או מצופה על מערכים multielectrode למדידת צפיפות סינפטית וכוח. באופן כללי, הוא צפוי כי פרוטוקול זה תניב הספירות עצבית תלת-ממד להציג סמנים מסוג תאים בוגרים מוגבלים, יוצרות הסינפסות פונקציונלי ולאחר להפגין פעילות פרץ ספונטני רשת סינפטית. יחד, מערכת זו מאפשרת והתרופות הקרנה חקירות מנגנונים של המחלה במודל מתאים יותר לעומת תרבויות חד שכבתי.

Introduction

האסטרוציטים הם סוג תא גליה מאוד שופע בתוך מערכת העצבים המרכזית (CNS) עם מגוון רחב של אחריות פונקציונלי מעבר תמיכה מבנית. באמצעות הפרשת synaptogenic מסיסים גורמי ורכיבים מטריצה חוץ-תאית (ECM), האסטרוציטים לסייע הממסד ואישכול של הסינפסות בוגרת במהלך פיתוח1. הם גם לשחק תפקיד חיוני בשמירה על בריאותם של פלסטיות של הסינפסות דרך חוץ-תאית איתות2,3,4,5, ולתרום יציבות לטווח ארוך של homeostatic סביבות על ידי ויסות אשלגן חוץ-תאית, גלוטמט, כמו גם את הפרשת סובסטרטים אנרגיה ו- ATP6,7,8. לבסוף הם יכולים לתרום עצבית על ידי המשפיעים על זרמים extrasynaptic9, יכולים להשפיע בעקיפין בפעילות באמצעות סוגי תאים אחרים כגון קידום myelination10. חשוב, כי חריגות או תפקוד לקוי של האסטרוציטים יכול להוביל תסמונות התפתחותיות רבות neuropathology למבוגרים, יש צורך ברור כדי לכלול האסטרוציטים לצד נוירונים בתוך רשתות עצביות מהונדסים על מנת גרסה משופרת מודל של הסביבה אנדוגני במוח. מאפיין אינטגרלי של האסטרוציטים הוא היכולת שלהם טופס דינמי אינטראקציות עם הסינפסות עצביים1,11,12. בהיעדר עכשיו, דונלד, נוירונים בצורת מספר מוגבל של הסינפסות, אשר באופן כללי גם חוסר בגרות פונקציונלי13.

האסטרוציטים האנושי להציג מאפיינים מורפולוגיים, תעתיק ופונקציונליים — כגון הגדלת גודלו ומורכבותו של גנים מסעף, כמו גם תלויי מין – כי הם לא recapitulated מכרסמים12,14, 15. כתוצאה מכך, מחקרים ניצול תאי גזע pluripotent אנושי (hPSC)-תאים עצביים נגזר יש להפוך לנפוץ כאמצעי בחינת מחלות הקשורות CNS במבחנה תוך פיתוח טיפולים חדשניים, פציעה מודלים, פרדיגמות לתרבות16 ,17. יתר על כן, hPSCs היתר חקר היווצרות האדם סינפסה ותפקוד ללא צורך רקמות ראשי18,19.

מחסום ההבנה שלנו של מה סוגי תאים שונים אותות לתרום פונקציה מעגל סינפטית היא חוסר רלוונטיות מודלים של המוח האנושי. יש צורך פלטפורמה המתאימה לסכם שלה רשתות סינפטית עם נאמנות גבוהה הפארמצבטית. לאחרונה, עניין התפתחה בייצור של מערכות התרבות תלת-ממד (בהרחבה המכונה ‘organoids,’ ‘spheroids’, או ‘מיני המוח’)20 לדגם מורכבים תלת מימדי (3D) מבנים ברמות הסלולר והדואר מאקרו. מערכות תלת-ממד תרבות שומרים על אינטראקציות ECM ו תאים-תאים הנמצאים בדרך כלל נעדר או מוגבלת במהלך coculture 2D אופייני פרדיגמות21,22. שפע של טכניקות קיימות עבור culturing23,spheroids עצבית 3D24,25; עם זאת, רבים מחייבים תקופות ממושכות תרבות (חודשים עד שנים) עבור שכבת שימור ופיתוח ספונטנית, עם המשתמש מפגין שליטה מעט מאוד על הפלט.

. כאן, להמחיש לנו שיטה שיטתית כדי במהירות, באופן עקבי bioengineer עצבית אינטראקציות בין סוגי תאים מרובים (הנוירונים הבדיל מראש, האסטרוציטים) נגזר hPSCs על ידי הרכבת תאים לתוך כדור cocultures (“אסטרואידים”)26 זה מסכם את הדברים המורכבות המורפולוגית אדם ספציפי ב- 3D. מערכת עצבית בצפיפות גבוהה זו יוצרת באופן שווה התפזרו עצבית יחוברו להשתלט על מאפייני בוגרת זמן, יכול להיות מוקרן או לבדיקה באופן תפוקה גבוהה. נדגים בפעם הראשונה האסטרוציטים האנושי זירוז פעילות רשת סינפטית פרץ באלה cocultures תלת-ממד. בנוסף, פרוטוקול זה ניתנת להתאמה בקלות ליצור כדורים בגדלים שונים, כדי לנצל את התאים שצוינו כדי זהויות אזוריות שונות של מערכת העצבים, וכדי ללמוד אינטראקציות של מספר סוגי תאים אחרים לפי הצורך.

Protocol

1. תא תרבות והכנות ריאגנט הערה: הפרוטוקולים בסעיף זה נכתבות לפי הסדר שבו הם מופיעים בפרוטוקול בידול (סעיף 2). ראה טבלה של חומרים עבור חומרים ואת מספרי קטלוג. להכין צלחות מצופה תרבית תאים. מטריצה חוץ-תאית (ECM) הפתרון ציפוי עם מדיה DMEM/F12 כדי להכין פתרו?…

Representative Results

כאשר מבוצעת כהלכה, פרוטוקול זה יפיק אוכלוסיות מוגדרות של cocultures תפקודית של האסטרוציטים28,33,34 / נוירונים35 המופקים hPSCs (איור 1 א’-1C), כמו מפורט בעבר26 , המתוארים כאן בשלבים 2.1 –…

Discussion

ב פרוטוקול זה, אנו מתארים שיטה שיטתית לייצור של תלת-ממד תחומי cocultures עצבית. הספירות המורכבות האסטרוציטים, הנוירונים, אשר נגזרות hPSCs באופן עצמאי. אבל לא המוקד של פרוטוקול זה, הדור של אוכלוסיות טהור של האסטרוציטים מ hPSCs28 הוא שלב קריטי והוא יכול להיות מאתגר מבחינה טכנית אם מבוצע ללא…

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

ברצוננו להודות ד ר אריק Ullian (UCSF) עבור קלט רוחני על העיצוב של נהלים אלה, ד ר מייקל וורד (NIH) לקבלת ייעוץ טכני על בידול iNeuron, סבא Barlas לניתוח תמונה ראשונית.

Materials

6 well plate Fisher Scientific 08-772-1B
15 ml conical tubes Olympus Plastics 28-101
Accutase Sigma A6964-100ML Detachment solution
AggreWell plate Stemcell Technologies 34850
Anti-Adherence Rinsing Solution Stemcell Technologies 7010 Prevent cell adhesion to microwell plates
Anti/anti Thermofisher 15240062
B27 Thermofisher 17504044 Media Supplement
BrainPhys neuronal medium Stemcell Technologies 5790 Neurophysiological basal medium alternative
Circular glass coverslips Neuvitro GG-12-oz
Cryostor CS10 Stemcell Technologies 7930 Cryopreservation medium with 10% DMSO
DMEM/F12 Thermofisher 10565-042 With GlutaMAX supplement
DMH-1 Stemcell Technologies 73634 HAZARD: Toxic if swallowed. Working concentration: 2 uM
Donkey serum Lampire Biological Laboratories 7332100 Working concentration: 5% in primary blocking buffer, 1% in secondary blocking buffer
Doxycycline Hydrochloride (Dox) Sigma D3072-1ml HAZARD: Toxic for pregnant women. Working concentration: 2 ug/mL
Epidermal growth factor (EGF) Peprotech AF-100-15 Working concentration: 10 ng/mL
Fibroblast growth factor-2 (FGF) Peprotech 100-18B Working concentration: 10 ng/mL
Fluoromount-G mounting solution Southern Biotech 0100-01
Glass slides Fisherbrand 22-037-246
Goat serum Lampire Biological Laboratories 7332500 Working concentration: 5% in primary blocking buffer, 1% in secondary blocking buffer
Hemacytometer or automatic cell counter Life Technologies AMQAX1000
Heparin Sigma H3149-50KU Working concentration: 2 mg/mL
Magnetic plate DLAB 8030170200
Matrigel membrane matrix Corning 354230 ECM coating solution. Working concentration: 80 ug/ml. Prepare on ice and ensure that pipettes, tubes, and media are pre-chilled.
MEA 2100 System Multichannel Systems MEA2100
Mounting solution
N2 Thermofisher 17502048 Media Supplement
OCT Tissue-Tek 4583 Tissue embedding solution for cryosectioning
Pap Pen (Aqua Hold) Scientific Device Laboratory 9804-02
Paraformaldehyde (PFA) Acros Organics 169650025 HAZARD: Toxic if inhaled. Working concentration: 4% in PBS
Phosphate buffered saline (PBS) Stemcell Technologies CA008-300
Poly-l-ornithine (PLO) Sigma P3655-100MG Working concentration: 0.5 mg/mL
Rectangular glass cover slips Fisherfinest Premium Superslip 12-545-88
ReLeSR Stemcell Technologies 5872 Detachment and passaging reagent
Rho-Kinase Inhibitor Y27632- (Y) Tocris 1254 Working concentration: 10 uM
SB431542 Stemcell Technologies 72234 Working concentration: 2 uM
Spinner flasks Fisher Scientific 4500-125
Sucrose Fisher Chemical S5-3 Working concentration: 20% or 30% in PBS
T25 Culture Flask Olympus Plastics 25-207 Vented caps
T75 Culture Flask Olympus Plastics 25-209 Vented caps
Terg-A-zyme Sigma Z273287-1EA Detergent. Working concentration: 1%
TeSR-E8 basal medium Stemcell Technologies 5940 Human pluripotent stem cell (hPSC) medium
TeSR-E8 supplements Stemcell Technologies 5940 Supplements for human pluripotent stem cell medium
TritonX-100 Sigma X100-500ML Detergent for cell permeabilization. Working concentration: 0.25% in blocking buffer
Trypan blue Invitrogen T10282
Antibodies
AlexaFluor 488 Thermofisher A-11029 Secondary antibody
AlexaFluor 594 Thermofisher A-11037 Secondary antibody
Ezrin Thermofisher MA5-13862 Primary antibody; astrocytes perisynaptic
GFAP Chemicon MAB360 Primary antibody; astrocytes
GFP Aves GFP-1020 Primary antibody; astrocytes
Glt1 Gift from Dr. Jeffrey Rothstein n/a Primary antibody; astrocytes
Homer Synaptic Systems 160 011 Primary antibody; neurons, post-synaptic
MAP2 Synaptic Systems 188 004 Primary antibody; neurons
PSD95 Abcam ab2723 Primary antibody; neurons, post-synaptic
S100 Abcam ab868 Primary antibody; astrocytes
Synapsin 1 Synaptic Systems 106 103 Primary antibody; neurons, pre-synaptic
TuJ1/β3-tubulin (TUBB3) Covance MMS-435P Primary antibody; neurons
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Riferimenti

  1. Ullian, E. M., Christopherson, K. S., Barres, B. A. Role for Glia in Synaptogenesis. Glia. 47, 209-216 (2004).
  2. Baldwin, K. T., Eroglu, C. Molecular mechanisms of astrocyte-induced synaptogenesis. Current Opinion in Neurobiology. 45, 113-120 (2017).
  3. Molofsky, A. V., et al. Astrocyte-encoded positional cues maintain sensorimotor circuit integrity. Nature. 509 (7499), 189-194 (2014).
  4. Sultan, S., et al. Synaptic Integration of Adult-Born Hippocampal Neurons Is Locally Controlled by Astrocytes. Neuron. 88, 957-972 (2015).
  5. Clarke, L. E., Barres, B. A. Emerging roles of astrocytes in neural circuit development. Nat Rev Neuroscience. 14 (5), 311-321 (2013).
  6. Cheung, G., Sibille, J., Zapata, J., Rouach, N. Activity-Dependent Plasticity of Astroglial Potassium and Glutamate Clearance. Neural Plasticity. , 109106 (2015).
  7. Ghezali, G., Dallerac, G., Rouach, N. Perisynaptic astroglial processes dynamic processors of neuronal information. Brain Struct Funct. 221, 2427-2442 (2016).
  8. Kimelberg, H. K., Nedergaard, M. Functions of Astrocytes and their Potential As Therapeutic Targets. Neurotherapeutics. 7, 338-353 (2010).
  9. Pál, B. Astrocytic Actions on Extrasynaptic Neuronal Currents. Frontiers in Cellular Neuroscience. 9, 474 (2015).
  10. Kiray, H., Lindsay, S. L., Hosseinzadeh, S., Barnett, S. C. The multifaceted role of astrocytes in regulating myelination. Experimental Neurology. 283, 541-549 (2016).
  11. Allen, N. J., Eroglu, C. Cell Biology of Astrocyte-Synapse Interactions. Neuron. 96 (3), 697-708 (2017).
  12. Krencik, R., van Asperen, J. V., Ullian, E. M. Human astrocytes are distinct contributors to the complexity of synaptic function. Brain Research Bulletin. 129, 66-73 (2017).
  13. Ullian, E. M., Sapperstein, S. K., Christopherson, K. S., Barres, B. A. Control of Synapse Number by Glia. Science. 291, 657-662 (2001).
  14. Oberheim Bush, N. A., Nedergaard, M. Do Evolutionary Changes in Astrocytes Contribute to the Computational Power of the Hominid Brain?. Neurochemical Research. 42 (9), 2577-2587 (2017).
  15. Han, X., et al. Forebrain Engraftment by Human Glial Progenitor Cells Enhances Synaptic Plasticity and Learning in Adult Mice. Cell Stem Cell. 12 (3), 342-353 (2013).
  16. Inoue, H., Nagata, N., Kurokawa, H., Yamanaka, S. iPS cells: a game changer for future medicine. The EMBO Journal. 33 (5), 409-417 (2014).
  17. Shi, Y., Inoue, H., Wu, J. C., Yamanaka, S. Induced pluripotent stem cell technology a decade of progress. Nature Reviews Drug Discovery. 16 (2), 115-130 (2017).
  18. Dodla, M. C., Mumaw, J., Stice, S. L. Role of astrocytes, soluble factors, cells adhesion molecules and neurotrophins in functional synapse formation: implications for human embryonic stem cell derived neurons. Stem Cell Res Ther. , 251-260 (2010).
  19. Krencik, R., Ullian, E. M. A cellular star atlas: using astrocytes from human pluripotent stem cells for disease studies. Frontiers in Cellular Neuroscience. 7, 1-10 (2013).
  20. Pasca, S. P. The rise of three-dimensional human brain cultures. Nature. 553 (7689), 437-445 (2018).
  21. Huch, M., Knoblich, J. A., Lutolf, M. P., Martinez-arias, A. The hope and the hype of organoid research. Development. 144, 938-941 (2017).
  22. Mason, J. O., Price, D. J. Building Brains in a Dish: Prospects for Growing Cerebral Organoids from Stem Cells. Neuroscienze. 334, 105-118 (2016).
  23. Kelava, I., Lancaster, M. A. Dishing out mini-brains: Current progress and future prospects in brain organoid research. Biologia dello sviluppo. 420 (2), 199-209 (2016).
  24. Kelava, I., Lancaster, M. A. Stem Cell Models of Human Brain Development. Cell Stem Cell. 18 (6), 736-748 (2016).
  25. Sloan, S. A., et al. Human Astrocyte Maturation Captured in 3D Cerebral Cortical Spheroids Derived from Pluripotent Stem Cells. Neuron. , 779-790 (2017).
  26. Krencik, R., et al. Systematic three-dimensional coculture rapidly recapitulates interactions between human neurons and astrocytes. Stem Cell Reports. 9 (6), 1745-1753 (2017).
  27. Chen, G., et al. Chemically defined conditions for human iPSC derivation and culture. Nature Methods. 8 (5), 424-429 (2011).
  28. Krencik, R., Zhang, S. -. C. Directed differentiation of functional astroglial subtypes from human pluripotent stem cells. Nature Protocols. 6 (11), 1710-1717 (2011).
  29. Du, Z. -. W., et al. Generation and expansion of highly pure motor neuron progenitors from human pluripotent stem cells. Nature Communications. 6, 6626 (2015).
  30. Neely, M. D., et al. DMH1, a highly selective small molecule BMP inhibitor promotes neurogenesis of hiPSCs: Comparison of PAX6 and SOX1 expression during neural induction. ACS Chemical Neuroscience. 3 (6), 482-491 (2012).
  31. Lippmann, E. S., Estevez-Silva, M. C., Ashton, R. S. Defined Human Pluripotent Stem Cell Culture Enables Highly Efficient Neuroepithelium Derivation Without Small Molecule Inhibitors. Stem Cells. 32, 1032-1042 (2014).
  32. Eggan, K., Kawada, J., Kaneda, S., Kirihara, T., Maroof, A. Generation of a Motor Nerve Organoid with Human Stem Cell-Derived Neurons. Stem Cell Reports. 9, 1441-1449 (2017).
  33. Krencik, R., Weick, J. P., Liu, Y., Zhang, Z. -. J., Zhang, S. -. C. Specification of transplantable astroglial subtypes from human pluripotent stem cells. Nature Biotechnology. 29 (6), 528-534 (2011).
  34. Krencik, R., et al. Dysregulation of astrocyte extracellular signaling in Costello syndrome. Science Translational Medicine. 7 (286), 286 (2015).
  35. Wang, C., et al. Scalable Production of iPSC-Derived Human Neurons to Identify Tau- Lowering Compounds by High-Content Screening. Stem Cell Reports. 9 (4), 1221-1233 (2017).
  36. Amin, H., Maccione, A., Marinaro, F., Zordan, S., Nieus, T., Berdondini, L. Electrical Responses and Spontaneous Activity of Human iPS-Derived Neuronal Networks Characterized for 3-month Culture with 4096-Electrode Arrays. Frontiers in Neuroscience. 10, (2016).
  37. Kapucu, F. E., Mäkinen, M. E., Tanskanen, J. M. A., Ylä-Outinen, L., Narkilahti, S., Hyttinen, J. A. K. Joint analysis of extracellular spike waveforms and neuronal network bursts. Journal of Neuroscience Methods. 259, 143-155 (2016).
  38. Ippolito, D. M., Eroglu, C. Quantifying Synapses: an Immunocytochemistry-based Assay to Quantify Synapse Number. Journal of Visualized Experiments. 45, 2-9 (2010).
  39. Zhang, Y., et al. Rapid single-step induction of functional neurons from human pluripotent stem cells. Neuron. 78 (5), 785-798 (2013).
  40. Odawara, A., Katoh, H., Matsuda, N., Suzuki, I. Physiological maturation and drug responses of human induced pluripotent stem cell-derived cortical neuronal networks in long-term culture. Scientific reports. 6, 26181 (2016).
  41. Bardy, C., Hurk, , et al. Neuronal medium that supports basic synaptic functions and activity of human neurons in vitro. PNAS. 112 (25), E2725-E2734 (2015).
  42. Monzel, A. S., et al. Derivation of Human Midbrain-Specific Organoids from Neuroepithelial Stem Cells. Stem Cell Reports. 8, 1144-1154 (2017).
  43. Lancaster, M. A., Knoblich, J. A. Generation of cerebral organoids from human pluripotent stem cells. Nature Protocols. 9 (10), 2329-2340 (2014).
  44. Dutta, D., Heo, I., Clevers, H. Disease Modeling in Stem Cell-Derived 3D Organoid Systems. Trends in Molecular Medicine. 23 (5), 393-410 (2018).
  45. Lancaster, M. A., et al. Cerebral organoids model human brain development and microcephaly. Nature. 501 (7647), 373-379 (2013).
  46. Qian, X., et al. Brain-Region-Specific Organoids Using Mini-bioreactors for Modeling ZIKV Exposure. Cell. 165 (5), 1238-1254 (2016).
  47. Yan, Y., et al. Derivation of Cortical Spheroids from Human Induced Pluripotent Stem Cells in a Suspension Bioreactor. Tissue Engineering Part A. , 1-46 (2016).
  48. Obien, M. E. J., Deligkaris, K., Bullmann, T., Bakkum, D. J., Frey, U. Revealing neuronal function through microelectrode array recordings. Frontiers in Neuroscience. 9 (JAN), 423 (2015).
  49. Hales, C. M., Rolston, J. D., Potter, S. M. How to Culture, Record and Stimulate Neuronal Networks on Micro-electrode Arrays (MEAs). Journal of Visualized Experiments. (39), 1-7 (2010).
  50. Shigetomi, E., Patel, S., Khakh, B. S. Probing the Complexities of Astrocyte Calcium Signaling. Trends in Cell Biology. 26 (4), 300-312 (2016).
  51. Bagley, J. A., Reumann, D., Bian, S., Lévi-strauss, J., Knoblich, J. A. Fused cerebral organoids model interactions between brain regions. Nat Methods. 14 (7), (2017).

Tags

Synaptic Microcircuit3D CoculturesAstrocytesNeuronsHuman Pluripotent Stem CellsNeural Cell TypesSynaptic Circuit FormationNeuroscienzeOrganoid TechnologiesDrug DevelopmentNeuroregenerationNeural ProgenitorsAstrocyte ProgenitorsAstrocyte SubtypesNeural InductionNeural MediumRho-kinase InhibitorECM-coated PlatesCell AggregationCell DissociationCell Identity ConfirmationCryo-preservation

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citazione di questo articolo
Cvetkovic, C., Basu, N., Krencik, R. Synaptic Microcircuit Modeling with 3D Cocultures of Astrocytes and Neurons from Human Pluripotent Stem Cells. J. Vis. Exp. (138), e58034, doi:10.3791/58034 (2018).
Scarica citazione
Ristampe e autorizzazioni

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image