Extração rápida, segura e simples Manual cabeceira de ácidos nucleicos para a detecção de vírus em amostras de sangue total
Summary
Aqui, apresentamos um protocolo para a extração de ácidos nucleicos de vírus rápida do vírus inactivados todo sangue. A extração é realizada diretamente em tubos de colheita de sangue e não requer nenhum equipamento ou eletricidade. O método não é dependente de instalações laboratoriais e pode ser usado em qualquer lugar (por exemplo, em hospitais de campanha).
Abstract
O diagnóstico rápido de uma infecção é essencial para a gestão do surto, contenção de risco e atendimento ao paciente. Anteriormente mostramos um método para a inactivação de cabeceira rápida do vírus Ebola durante a amostra de sangue para testes de ácidos nucleicos seguro (NA), adicionando um tampão de Lise comercial/ligação diretamente para os tubos de coleta de sangue do vácuo. Usando essa abordagem de inactivação de cabeceira, nós desenvolvemos um seguro, rápido e simplificado cabeceira NA extração método para a detecção subsequente de um vírus no sangue de inteiro inactivadas tampão lise/vinculação. A extração de nd é realizada diretamente em tubos de coleta de sangue e não requer nenhum equipamento ou eletricidade.
Depois que o sangue é colhido para o buffer de Lise/vinculação, os conteúdos são misturados por inversão do tubo com a mão, e a mistura é incubada por 20 min em temperatura ambiente. Partículas de vidro magnética (pop) são adicionadas ao tubo, e o conteúdo é misturado por inversão do tubo de coleta com a mão. O pop é então coletados no lado do tubo de coleta de sangue usando um suporte magnético ou um íman e uma faixa de borracha. O pop é lavados três vezes, e depois da adição de tampão de eluição directamente para o tubo de coleta, NAs está pronto para testes de at, tais como qPCR ou amplificação isotérmica laço (lâmpada), sem a remoção do pop da reação. O método de extração de at não é dependente de quaisquer instalações de laboratório e pode facilmente ser usado em qualquer lugar (por exemplo, em hospitais de campanha e enfermarias de isolamento). Quando este método de extração de nd é combinado com a lâmpada e um instrumento portátil, um diagnóstico pode ser obtido dentro de 40 min da coleta de sangue.
Introduction
Em situações de surto de vírus, quando os pacientes estão confinados para as enfermarias de isolamento ou quando houver necessidade de um diagnóstico rápido, um seguro, simples e preciso diagnóstico molecular do point-of-care é imperativo para a contenção de cuidados e risco de paciente. Os dois surtos virais recentes, do vírus Ebola (EBOV) na África Ocidental (2013) e o vírus Zika na América do Sul (2015), aumentaram o interesse na melhoria point-of-care molecular testes de diagnóstico, tais como isothermal mediada por laço de transcrição reversa amplificação (RT-lâmpada)1,2 e recombinase polimerase amplificação (RPA)3,4. RT-lâmpada tanto RPA são testes moleculares rápidos, sensíveis e específicas que podem ser executadas em preparações de amostra simplificada. Para o vírus Zika, RT-lâmpada foi combinada com um ensaio de fluxo lateral (LFA), que pode detectar vírus Zika em amostras de sangue não-purificada dentro de 30 min1; no entanto, para EBOV, que é classificado como um patógeno do grupo 4 de risco e é altamente contagiosa, as amostras precisam ser manipuladas em Biossegurança de nível 4 (BSL-4) condições e inativado antes de quaisquer procedimentos de diagnósticos seguros podem ser realizados.
Métodos de inativação simplificado para EBOV, tais como a adição de buffers de Lise para a amostra2,3,4,5, foram utilizados durante o surto; no entanto, esses métodos requerem tratamento em condições de BSL-4 com equipamentos de laboratório, tais como armários de biossegurança BSL-3, centrífugas, blocos de aquecimento e pipetas, no mínimo. Este equipamento normalmente não está presente em enfermarias de isolamento ou em hospitais de campanha. Para superar este desafio, foram feitas tentativas para executar diagnósticos em malas3, e vários dispositivos portáteis e máquinas foram desenvolvidos [por exemplo, um dispositivo portátil para extração de ácidos nucleicos (at)]6. No entanto, amostras de EBOV-positivo ainda precisam ser inativado antes que estes dispositivos podem ser usados.
Temos anteriormente relatado um método de inativação de vírus cabeceira rápida para o EBOV7, vírus Vaccinia e Cowpox vírus8 pela adição de um tampão de Lise/ligação comercial para tubos de colheita de sangue vácuo ordinário, permitindo o direto transferência de sangue do paciente para a inactivação de tampão7. Esta inativação directa e imediata, em um sistema fechado elimina a necessidade para a manipulação das amostras usando qualquer confinamento rigoroso, tais como condições de BSL-47, e as amostras podem ser manipuladas em condições normais de BSL-2. Este método de inativação é compatível com vários sistemas de extração de at, tais como robôs e kits de purificação mão7; no entanto, esses métodos exigem equipamento de laboratório, como robôs, centrifugadores e eletricidade, que não estão sempre presentes em configurações do campo ou dentro de enfermarias de isolamento.
Neste relatório, descrevemos um seguro, rápido e simplificado NA extração método manual para detecção molecular subsequente de um vírus no sangue de inteiro inactivadas tampão lise/vinculação. O método de extração de at não exige qualquer equipamento que não seja um suporte magnético/imã. Não centrifugadores, blocos, ou eletricidade de aquecimento são necessários para a extração de at. Portanto, esse método não é dependente de instalações laboratoriais e pode facilmente ser usado em qualquer lugar (por exemplo, em hospitais de campanha, em enfermarias de isolamento, ou com as configurações de recursos Baixos). O método de extração de nd é rápida e simples e pode ser usado diretamente em qualquer testes de at a jusante, tais como qPCR, RT-qPCR, lâmpada ou RT-lâmpada. Quando este método de extração de at é combinado com a lâmpada e um instrumento isotérmico orientado a bateria portátil, um diagnóstico de cabeceira pode ser obtido dentro de 40 min da coleta de sangue.
Protocol
Representative Results
Discussion
Neste relatório, nós descrevemos um seguro, rápido e simples cabeceira NA extração método manual para detecção molecular a jusante de um vírus no sangue de inteiro inactivadas tampão lise/vinculação. O método de extração NA descrito foi desenvolvido para ser executada diretamente em amostras de sangue total coletadas em tubos de colheita de sangue vácuo contendo a Lise/ligação tampão (Tabela de materiais)7. Esse buffer específico inactivates EBOV<sup class="xre…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos a Susanne Lopes Rasmussen e Solvej Kolbjørn Jensen para sua assistência técnica e para a manipulação das amostras clínicas. Este projeto faz parte do consórcio EbolaMoDRAD, que recebeu financiamento da inovadora medicina iniciativa 2 empresa comum sob concessão acordo N ° 115843. Esta empresa comum recebe apoio da investigação de Horizonte 2020 da União Europeia e programa de inovação e da EFPIA.
Materials
| Vacutainer K2 EDTA tubes (4 mL) | Becton Dickinson | 368861 | |
| Plus Blood Collection | Becton Dickinson | 362725 | |
| 23G x 1 needle | Becton Dickinson | 300800 | |
| LUER LOK syringe (3 mL) | Becton Dickinson | 309658 | |
| Butterfly needle with small-bore extension tubing | Jørgen Kruuse A/S | 121714 | |
| 1% Virkon | Nomeco A/S | 849265 | |
| MagNA Pure LC DNA Isolation Kit I – Lysis/Binding Buffer – Refill | Roche Diagnostics A/S | 03246752001 | |
| MagNA Pure LC Total Nucleic Acid Isolation Kit | Roche Diagnostics A/S | 3038505001 | |
| Nunc™ Biobanking and Cell Culture Cryogenic Tubes (1,8 mL) | Thermo Fisher Scientific | 375418 | |
| Nunc™ Biobanking and Cell Culture Cryogenic Tubes (3,6 mL) | Thermo Fisher Scientific | 379189 | |
| Nunc™ Biobanking and Cell Culture Cryogenic Tubes (4,5 mL) | Thermo Fisher Scientific | 379146 | |
| DynaMag™-5 Magnet | Thermo Fisher Scientific | 12303D | |
| Transfer pipette (3.5 mL) | Sarstedt | 86.1171.010 | |
| Thermo Scientific™ Samco™ Fine Tip Transfer Pipettes (1.5 mL) | Thermo Fisher Scientific | 231 | |
| Thermo Scientific™ Nunc™ 50 mL Conical Sterile Polypropylene Centrifuge Tubes | Thermo Fisher Scientific | 339652 |
Riferimenti
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