Um gradiente de temperatura de ensaio para determinar preferências térmicas de larvas de Drosophila
Summary
Aqui, apresentamos um protocolo para determinar a temperatura ambiental preferida de larvas de Drosophila usando um gradiente térmico contínuo.
Abstract
Muitos animais, incluindo a mosca da fruta, Drosophila melanogaster, são capazes de discriminar diferenças minutos em temperatura ambiente, o que permite que eles buscar sua paisagem termal preferida. Para definir as preferências de temperatura de larvas ao longo de um intervalo definido de linear, desenvolvemos um ensaio usando um gradiente de temperatura. Para estabelecer um gradiente de single-direcional, dois blocos de alumínio são conectados aos banhos de água independentes, cada um deles controla a temperatura dos blocos individuais. Os dois blocos defina os limites inferior e superiores do gradiente. O gradiente de temperatura é estabelecido pela colocação de uma placa de alumínio revestido com agarose sobre os dois blocos de água controlados para que a placa se estende a distância entre eles. As extremidades da placa de alumínio que é definido na parte superior dos blocos de água define as temperaturas mínimas e máximos, e as regiões entrelinhas os dois blocos formam um gradiente linear de temperatura. O ensaio de gradiente pode ser aplicado para as larvas de diferentes idades e pode ser usado para identificar os mutantes que apresentam fenótipos, tais como aqueles com mutações que afetam os genes que codificam os canais TRP e opsins, que são necessários para a discriminação de temperatura.
Introduction
Thermotaxis é empregado por animais móveis para selecionar um ambiente com as mais favoráveis condições1,2,3. Se o clima é excessivamente quente ou frio, esse comportamento é vital para a sobrevivência. Além disso, muitos animais são sensíveis às diferenças muito pequenas em temperatura na faixa de confortável e procuram ambiente com uma temperatura ideal. Isto é de particular importância para organismos poiquilotérmicos como moscas de fruta, que equilibrar a temperatura corporal com o meio ambiente. Ensaios para monitorar thermotaxis larval têm sido fundamentais para identificar e clarificar as funções dos sensores moleculares como Drosophila transitória do Receptor potencial (TRP) canais4,5,6, rhodopsins7,8e geleificação do receptor receptores (IRs)9, que dotar estes animais com sensibilidades de temperatura ao longo de intervalos de temperatura diferentes.
Um teste de escolha bidirecional fornece uma abordagem para estudar as preferências térmicas em larvas6,7. O ensaio envolve a criação de duas zonas de temperatura distintas e permite que os animais selecionar um lado sobre o outro. Os resultados dos testes de escolha de duas vias podem ser robustos, especialmente se as diferenças de temperatura entre as duas opções são grandes. Além disso, uma vez que cada ensaio envolve Tabulação apenas dois grupos, os dados podem ser expressas como um índice de preferência simples. A facilidade e simplicidade de escolha bidirecional ensaios também são aptos para telas de genéticas. No entanto, uma grande limitação é que muitos experimentos são necessários para estabelecer a temperatura preferida dos animais selvagem-tipo ou mutantes.
Um ensaio de gradiente oferece a oportunidade de estabelecer a temperatura preferida em um único ensaio8. Além disso, ao contrário do teste de escolha de duas vias, permite a avaliação da distribuição de um grupo de animais, quando confrontado com uma série contínua de temperaturas. Um ensaio de gradiente usa uma placa de Petri e único animais e é well-suited para caracterizar o comportamento detalhado de cada animal10. No entanto, desde pratos de Petri são redondos, os tamanhos das zonas de temperatura variam e são progressivamente menores dependendo da distância do centro. Portanto, esta configuração não é ideal para monitorar as seleções de temperatura das populações de animais.
Um aparelho gradiente térmico contínuo que é adequado para avaliar as preferências de temperatura dos grupos de larvas emprega uma arena rectangular e está descrito aqui. É simples de construir e montar o aparelho. Além disso, o gradiente é linear e é flexível, como ele pode ser usado para avaliar a thermotaxis ao longo de intervalos de temperatura de 10 ° C a 42 ° C. O ensaio é rápido e simples de executar e produz dados reprodutíveis. Além de relatar a temperatura favorecida de larvas, revela as preferências da população de animais sobre uma escala linear inteira em uma única experiência. Devido a estas vantagens, é uma excelente escolha para a identificação de genes necessários para thermotaxis.
Protocol
Representative Results
Discussion
Para garantir o sucesso do presente protocolo, é importante tomar medidas para obter números adequados de larvas a realizar os experimentos. Estes incluem pre-alimentando as moscas em frascos de levedura contendo colar para 2-3 d melhorar a postura de ovos. Os frascos precisam ser colocados em uma bandeja contendo frascos de água e colocado em um saco plástico transparente, que mantém a umidade dos alimentos e promove a alimentação eficaz por larvas, permitindo a exposição aos ciclos normais de claro-escuro. No …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
C.M. é suportado pelo financiamento do NEI (EY008117, EY010852), NIDCD (DC007864, DC016278) e o NIAID (1DP1AI124453).
Materials
| Gradient assay apparatus | |||
| PolyScience 9106, Refrigerated/Heated 6L Circulating Bath | Thomas Scientific | 9106 | This model is discontinued. Updated replacement models include: 1186R00 and 1197U04 for 120 V, 60 Hz, or 1184L08 and 1197U04 for 240 V, 50 Hz. |
| Aluminum assay plate (for single directional gradient) | Outer size: 14 x 10.1 x 0.9 cm, inner size: 12.9 x 8.7 x 0.8 cm, black anodized. | ||
| Aluminum plate (for bidirectional gradient) | 25 x 22 x 0.2 cm, black anodized. | ||
| Aluminum block | Outer size: 25.5 x 5 x 1.4 cm, parameters of inner channels are shown in Figure 1D. | ||
| Connector for aluminum blocks and tubing | McMaster-Carr | 91355K82 | |
| Tygon Sanitary Silicone Tubing | Tygon | 57296 | 1/4" ID x 3/8" OD x 1/16" wall |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Items and reagents for assay | |||
| Pestle | USA Scientific | 17361 | Pestle for 1.5 mL microcentrifuge tubes |
| Thermometer | Fluke | 51II | |
| Thermocouple | Fluke | K type | |
| Universal microplate lid | Corning | 6980A77 | |
| 35 mm dish | Corning | 9380D40 | |
| Labeling tape (for bidirectional gradient) | Fisher Scientific | 15-951 | Fisherbrand labeling tape 2 in x 14 yds |
| Agarose | Invitrogen | 16500500 | Prepare 1% solution |
| Sucrose | Sigma | S0389-5KG | Prepare 18% solution right before starting assay |
| Paint brush | Fisher Scientific | 11860 | |
| 50 mL centrifuge tubes | Denville | C1062-P | |
| Scoopula | Fisher Scientific | 14-357Q | |
| 500 mL round wide-mouth bottle | Pyrex | 1395-500 | |
| Cell strainer (300 mm pore) | PluriSelect | 43-50300 | Optional item for larvae washing |
| Cardboard box (vial tray) | Genesee Scientific | FS32-124 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Drosophila food | |||
| Distilled water | 22,400 mL | ||
| Cornmeal, yellow (extra fine mesh,flocked) 20 kg | LabScientific Inc. | NC0535320 | 1,609 g |
| Brewers yeast 100 lbs | MP Biomedicals | ICN90331280 | 379 g |
| NutriSoy® Soy Flour (10 kg/unit) | Genesee Scientific | 62-115 | 221 g |
| Drosophila Agar, Type II (5 kg) | Genesee Scientific | 66-103 | 190 g |
| Karo light corn syrup | Karo | 1,700 mL | |
| Methyl 4-hydroxybenzoate (suspend in 200 proof ethanol) | Sigma Aldrich | H5501-5KG | 72 g/240 mL |
| Propionic acid puriss. p.a.,>99.5% (GC) | Sigma Aldrich | 81910-1 L | 108 mL |
| Phosphoric acid ACS reagent, ≥85 wt. % in H2O | Sigma Aldrich | 438081-500 mL | 8.5 mL |
Riferimenti
- Fowler, M. A., Montell, C. Drosophila TRP channels and animal behavior. Life Sci. 92, 394-403 (2013).
- Palkar, R., Lippoldt, E. K., McKemy, D. D. The molecular and cellular basis of thermosensation in mammals. Curr Opin Neurobiol. 34, 14-19 (2015).
- Vriens, J., Nilius, B., Voets, T. Peripheral thermosensation in mammals. Nat Rev Neurosci. 15 (9), 573-589 (2014).
- Rosenzweig, M., et al. The Drosophila ortholog of vertebrate TRPA1 regulates thermotaxis. Genes Dev. 19, 419-424 (2005).
- Kwon, Y., Shim, H. S., Wang, X., Montell, C. Control of thermotactic behavior via coupling of a TRP channel to a phospholipase C signaling cascade. Nat Neurosci. 11, 871-873 (2008).
- Kwon, Y., Shen, W. L., Shim, H. S., Montell, C. Fine thermotactic discrimination between the optimal and slightly cooler temperatures via a TRPV channel in chordotonal neurons. J Neurosci. 30 (31), 10465-10471 (2010).
- Shen, W. L., et al. Function of rhodopsin in temperature discrimination in Drosophila. Science. 331 (6022), 1333-1336 (2011).
- Sokabe, T., Chen, H. S., Luo, J., Montell, C. A switch in thermal preference in Drosophila larvae depends on multiple rhodopsins. Cell Rep. 17, 336-344 (2016).
- Ni, L., et al. The Ionotropic Receptors IR21a and IR25a mediate cool sensing in Drosophila. Elife. 5, 13254 (2016).
- Luo, L., et al. Navigational decision making in Drosophila thermotaxis. J Neurosci. 30 (12), 4261-4272 (2010).
- Ashburner, M., Golic, K. G., Hawley, R. S. . Drosophila: a laboratory handbook. , (2005).
