Summary

초파리 애벌레의 열 환경 설정을 결정 하는 온도 분석 결과

Published: June 25, 2018
doi:

Summary

여기, 우리는 연속 열 그라디언트를 사용 하 여 초파리 애벌레의 기본 환경 온도 결정 하는 프로토콜 제시.

Abstract

많은 동물, 과일 파리, 초파리 melanogaster를 포함 하 여 차별 분 차이 환경 온도를 선호 그들의 열 조를 찾아 그들을 가능 하 게 할 수 있다. 애벌레의 온도 환경 정의 된 선형 범위를 정의 하려면 우리는 온도 기울기를 사용 하 여 분석 결과 개발 했다. 단일 지향성 그라디언트를 설정 하려면 두 개의 알루미늄 블록 독립 물 탕, 각각의 개별 블록의 온도 제어에 연결 됩니다. 해당 하위 및 상위 제한을 설정 하는 두 개의 블록. 온도 기울기는 접시에 걸쳐 그들 사이의 거리는 두 물 제어 블록 위에 agarose 코팅 알루미늄 플레이트를 삽입 하 여 설정 됩니다. 끝 물 블록 위에 설정 된 알루미늄 플레이트의 최소 및 최대 온도 정의 하 고 지역 사이 선형 온도 기울기를 형성 하는 두 개의 블록. 그라데이션 분석 결과 다른 연령대의 애벌레에 적용할 수 있는 고 고기, 인코딩 TRP 채널 및 opsins, 온도 차별에 필요한 유전자에 영향을 미치는 돌연변이 등을 전시 하는 돌연변이 식별 하기 위해 사용할 수 있습니다.

Introduction

Thermotaxis는 모바일 동물 선택 가장 유리한 조건1,2,3환경 하에 고용 됩니다. 지나치게 뜨겁거나 차가운 기후 인 경우이 문제는 생존을 위해 생명 이다. 또한, 많은 동물 편안한 범위에서 온도에 아주 작은 차이에 민감한 고 이상적인 온도 환경. 이 같은 환경과 그들의 체온을 equilibrate 과일 파리 poikilothermic 유기 체에 대 한 특정 중요성 이다. 애벌레 thermotaxis 모니터링 분석 수단이 식별, Drosophila 일시적인 수용 체 잠재력 (TRP) 채널4,,56, 같은 분자 센서의 역할을 명확히 rhodopsins7,8와 ionotropic 수용 체 수용 체 (국세청)9, 다른 온도 범위와 온도 감도이 동물을 부여.

양방향 선택 테스트 애벌레6,7열 기본을 공부 하는 한 가지 방법은 제공 합니다. 분석 결과 수반 두 가지 온도 영역을 설정 하 고 다른 한쪽을 선택 하는 동물을 수 있습니다. 양방향 선택 테스트에서 결과 강력 하 고, 두 가지 옵션 사이의 온도 차이가 큰 경우 특히 수 있습니다. 또한, 각 분석 결과 두 그룹을 tabulating 포함, 데이터는 간단한 기본 색인으로 표현할 수 있습니다. 편리 하 고 양방향 선택 분석 실험의 단순 유전 스크린 의무가 있습니다. 그러나, 주요 한계는 많은 실험은 야생-타입 또는 돌연변이 동물의 원하는 온도 설정 하는 데 필요한입니다.

그라데이션 분석 결과 단일 분석 결과8원하는 온도 설정할 기회를 제공 합니다. 연속 범위의 온도 직면할 때 또한, 양방향 선택 테스트와는 달리 그것은 동물의 그룹의 분포의 평가 허용. 한 그라데이션 분석 결과 페 트리 접시를 사용 하 여 단일 동물 이며 개별 동물10의 상세한 동작을 특성화 하는 데 적합 합니다. 그러나, 접시 라운드 이기 때문에, 온도 영역의 크기 변화 하 고 중심 으로부터 거리에 따라 점차적으로 작은. 따라서,이 설정 온도 선택의 동물의 인구를 모니터링에 이상적입니다.

애벌레의 그룹의 온도 선호를 평가 하기 위해 적합 한 연속 열 그라데이션 기구 직사각형 경기장을 고용 하 고 여기 설명. 기구는 생성 하 고 조립 하기 쉽습니다. 또한, 그라데이션, 선형 이며 유연 하 고, 42 ° c에 10 ° C에서 큰 온도 범위 동안 thermotaxis를 평가 하는 데 사용할 수 있습니다. 분석 결과 신속 하 고 간단 하 게 수행 하 고 재현 가능한 데이터를 생성 합니다. 애벌레의 선호 온도 보고, 뿐만 아니라 그것은 하나의 실험에서 전체 선형 범위 동물의 인구의 환경 설정을 보여준다. 이러한 장점으로 인해 thermotaxis에 필요한 유전자를 식별 하는 데 탁월한 선택 이다.

Protocol

1. 장비 제조 및 조립 장치 그라데이션 분석 실험 단일 방향 그라데이션 분석 결과 대 한 알루미늄 분석 결과 번호판 조작. 트림 및 밴드 톱을 사용 하 여 알루미늄의 한 조각에서 각 알루미늄 분석 결과 플레이트 (그림 1A)를 갈기 고 다음 크기와 수직 밀 날카로운: 외부 크기 140 x 100 x 9 mm 이며 내부 크기는 130 x 90 x 8 mm (그림 1B). 애벌레를 시?…

Representative Results

18 °-28 ° C 단일 방향 설정 그라데이션, 우리 두 물 탕의 온도를 설정 16.8 ° C와 31 ° C 우리는 agarose 젤 표면 (그림 2C, 2E)의 극단적인 끝에 모든 6 영역, 영역 사이의 테두리 라인의 상단과 하단에서 26 위치에서 온도 측정 하 여 13 지점에서 온도 얻을. 그라데이션에 따라 온도 분포는 거의 선형 (Y = 0.9672 * X + 16.19, R2 = 0.9961) (<strong class…

Discussion

이 프로토콜의 성공을 위해 실험을 수행 하는 애벌레의 적절 한 숫자를 얻기 위해 조치를 취할 중요 하다. 전 달걀 누워 개선 하기 위해 2-3 d에 대 한 효 모 붙여넣기 포함 된 튜브에 파리를 먹이 포함 됩니다. 튜브 물 튜브를 포함 하는 쟁반에 배치 하는 식품의 수 분을 유지 하 고 촉진 효과 먹이 애벌레에 의해 정상적인 빛 어두운 주기에 노출을 허용 하는 동안 투명 한 플라스틱 가방에 포함 해야 …

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

입방 미터 여 NIDCD (DC007864, DC016278) (EY008117, EY010852) NEI에서 자금 지원 및 NIAID (1DP1AI124453).

Materials

Gradient assay apparatus
PolyScience 9106, Refrigerated/Heated 6L Circulating Bath Thomas Scientific 9106 This model is discontinued. Updated replacement models include: 1186R00 and 1197U04 for 120 V, 60 Hz, or 1184L08 and 1197U04 for 240 V, 50 Hz.
Aluminum assay plate (for single directional gradient) Outer size: 14 x 10.1 x 0.9 cm, inner size: 12.9 x 8.7 x 0.8 cm, black anodized.
Aluminum plate (for bidirectional gradient) 25 x 22 x 0.2 cm, black anodized.
Aluminum block Outer size: 25.5 x 5 x 1.4 cm, parameters of inner channels are shown in Figure 1D.
Connector for aluminum blocks and tubing McMaster-Carr 91355K82
Tygon Sanitary Silicone Tubing Tygon 57296 1/4" ID x 3/8" OD x 1/16" wall
Name Company Catalog Number Comments
Items and reagents for assay
Pestle USA Scientific 17361 Pestle for 1.5 mL microcentrifuge tubes
Thermometer Fluke 51II
Thermocouple Fluke K type
Universal microplate lid Corning 6980A77
35 mm dish Corning 9380D40
Labeling tape (for bidirectional gradient) Fisher Scientific 15-951 Fisherbrand labeling tape 2 in x 14 yds
Agarose Invitrogen 16500500 Prepare 1% solution
Sucrose Sigma S0389-5KG Prepare 18% solution right before starting assay
Paint brush Fisher Scientific 11860
50 mL centrifuge tubes Denville C1062-P
Scoopula Fisher Scientific 14-357Q
500 mL round wide-mouth bottle Pyrex 1395-500
Cell strainer (300 mm pore) PluriSelect 43-50300 Optional item for larvae washing
Cardboard box (vial tray) Genesee Scientific FS32-124
Name Company Catalog Number Comments
Drosophila food
Distilled water 22,400 mL
Cornmeal, yellow (extra fine mesh,flocked) 20 kg LabScientific Inc. NC0535320 1,609 g
Brewers yeast 100 lbs MP Biomedicals ICN90331280 379 g
NutriSoy® Soy Flour (10 kg/unit) Genesee Scientific 62-115 221 g
Drosophila Agar, Type II (5 kg) Genesee Scientific 66-103 190 g
Karo light corn syrup Karo 1,700 mL
Methyl 4-hydroxybenzoate (suspend in 200 proof ethanol) Sigma Aldrich H5501-5KG 72 g/240 mL
Propionic acid puriss. p.a.,>99.5% (GC) Sigma Aldrich 81910-1 L 108 mL
Phosphoric acid ACS reagent, ≥85 wt. % in H2O Sigma Aldrich 438081-500 mL 8.5 mL

Riferimenti

  1. Fowler, M. A., Montell, C. Drosophila TRP channels and animal behavior. Life Sci. 92, 394-403 (2013).
  2. Palkar, R., Lippoldt, E. K., McKemy, D. D. The molecular and cellular basis of thermosensation in mammals. Curr Opin Neurobiol. 34, 14-19 (2015).
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  8. Sokabe, T., Chen, H. S., Luo, J., Montell, C. A switch in thermal preference in Drosophila larvae depends on multiple rhodopsins. Cell Rep. 17, 336-344 (2016).
  9. Ni, L., et al. The Ionotropic Receptors IR21a and IR25a mediate cool sensing in Drosophila. Elife. 5, 13254 (2016).
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  11. Ashburner, M., Golic, K. G., Hawley, R. S. . Drosophila: a laboratory handbook. , (2005).

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Citazione di questo articolo
Liu, J., Sokabe, T., Montell, C. A Temperature Gradient Assay to Determine Thermal Preferences of Drosophila Larvae. J. Vis. Exp. (136), e57963, doi:10.3791/57963 (2018).

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