Корректура и ДНК ремонт пробирного анализа единичных нуклеотидных расширение и MALDI-TOF масс-спектрометрии с помощью
Summary
Не помечены, Радио изотопный метод ДНК-полимеразы корректуры и пробирного ремонта ДНК была разработана с помощью стратегии расширения единичных нуклеотидных и разрешением MALDI-TOF масс-спектрометрии. Assay доказал, чтобы быть очень конкретные, простой, быстрый и легко выполнять проверки правописания и ремонт патчи короче, чем 9-нуклеотидов.
Abstract
Поддержание генома и его верным репликации имеет первостепенное значение для сохранения генетической информации. Чтобы оценить высокой верности репликации, мы разработали простой-меченых и радио изотопный метод, с помощью матрицы помощь лазерная ионизация десорбции с время полета (MALDI-TOF) массового спектрометрия (МС) анализ для изучения корректура. Здесь, ДНК-полимеразы [например, фрагменты фрагмент ДНК-полимеразы кишечной палочки (KF) я (Поль я) в этом исследовании] присутствии всех четырех dideoxyribonucleotide трифосфаты используется для обработки дуплекс несоответствие грунт шаблон. Несоответствие грунтовка затем корректировать/расширенный и подвергается MALDI-TOF MS. Продукция отличается изменения массы грунта до единичных нуклеотидных вариации. Главное корректура также может определяться для внутреннего одного несоответствия, хотя и в разных эффективности. Несоответствия, расположенный в 2-4-нуклеотидов (nt) от 3′ конца были эффективно корректируемый Поль я, и несоответствие в 5 nt от грунтовки terminus показал только частичное исправление. Не корректура произошло для внутренних несоответствий, расположенный на 6-9 nt от грунт 3′ конца. Этот метод может также применяться для ремонта анализов ДНК (например, оценки базы поражения ремонт субстратов для ремонта пути Эндо V). Грунты, содержащие 3′ предпоследний deoxyinosine (dI) поражения могут быть исправлены путем Поль я. Действительно предпоследний T-I, G-I и A-я субстратов был их последний 2 ди содержащих нуклеотидов подакцизным, Поль я перед добавлением правильный ddN 5′-монофосфат (ddNMP) во время предпоследнего C-я несоответствия были мириться Пол I, позволяя грунт, чтобы быть продлен без ремонт, демонстрируя, что чувствительность и разрешение MS анализа для измерения репарации ДНК.
Introduction
Корректура функции ДНК полимеразы во время репликации ДНК важны для обеспечения высокоточной генетической информации, которая должна быть передана потомству1,2,3,4, 5,6,7. Возможность оценить вклад полимеразы, корректура экзонуклеаз бы уточнить механизмы защиты генетической стабильности.
Радиоизотопные маркировки и гель на основе анализов в сочетании с денситометрических анализ autoradiograms или фосфора изображений8,9,10 традиционно использовались для выявления корректура активность ДНК полимеразы. Хотя функциональные, эти анализы являются трудоемкий, дорого и не поддаются форматов высокой пропускной способности. Кроме того радиоизотопов страдают вопросы безопасности, включая удаление отходов. В качестве альтернативы корректура мероприятия были проанализированы флуориметрический методов. Например 2-aminopurine (2-AP) могут включаться в расширение продуктов во время в vitro полимеразы корректура анализов производить флуоресцентного сигнала11,12. К сожалению эти подходы страдают от низкой специфичности, так как 2-AP можно спарить с тимин и цитозин. Более поздние подходы включают чувствительные основанные на G-четырехместных светящиеся переключатель на зонд для полимеразы 3′ – 5′ при exonuclease пробирного13 , а также индивидуально меченых флуоресцентного зонда для полимеразы, корректура assay который преодолевает некоторые из вышеупомянутые недостатки14. Энтузиазм для этих методов флуориметрический уменьшается из-за необходимости конкретных маркировки ДНК субстратов.
В противоположность этому, MALDI-TOF MS для анализа ДНК был нанят в assay PinPoint, где грунт расширения реакции с неподписанных 4 ddNTPs может использоваться для идентификации полиморфизмов данного Локус15,16,17 и была широко принята в клинических приложений для обнаружения мутаций и диагнозов рака18. Используя эти основные принципы, мы создали ярлык бесплатно пробирного в vitro определения ДНК-полимеразы, корректура активности, высокое разрешение, высокая специфичность и высок объём потенциал использование MALDI-TOF г-жа е. Коли ДНК-полимеразы, я фрагменты фрагмент как модель фермента, dideoxyribonucleotide трифосфаты (ddNTPs), как подложки могут принимать «моментальных снимков» корректуры продуктов после единичных нуклеотидных расширение через MALDI-TOF MS (рис. 1).
Кроме того этот метод также был разработан для assay ремонта ДНК где грунты, содержащий 3′ предпоследний ди поражения подвергаются ГСМ, которую я ремонт assay который имитирует Эндо V порезал ремонт интермедиатов. Хотя не поняты, путь ремонт Эндо V является единственной системой ремонт известный нанимать Пол я корректура деятельность при exonuclease для поражения иссечение19,20. С помощью MALDI-TOF MS, мы показываем патч четко определенные ремонт где ди может быть подакцизным, Поль я когда происходящих в последние 2 nt грунтовки перед добавлением правильно дополняет нуклеотидов.
Для изучения корректуры и репарации ДНК этот метод быстрее и менее трудоемким, чем предыдущие методы и предоставляет дополнительную информацию к механизму и функции.
Protocol
Representative Results
Discussion
Это исследование описано пошаговое корректура деятельности пробирного анализируемой выбранного коммерческого инструмента (см. Таблицу материалы) с использованием MALDI-TOF MS. Основные преимущества включают, что грунт и шаблон, лейбл бесплатно и легко выполнять, позволяя большую…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы благодарим NCFPB комплексной основной объект для функциональной геномики (Тайбэй, Тайвань) и в NRPB Фармакогеномика лаборатории (Тайбэй, Тайвань) за их техническую поддержку. Эта работа была поддержана научно-исследовательских грантов от министерства науки и технологии, Тайбэй, Тайвань, РПЦ [наиболее 105-2320-B-002-047] для Ху Вэй-Яо, Тайваньский фонд здоровья (L-и.л.) [наиболее 105-2628-B-002-051-MY3] для Су Кан-Йи и [ Most-105-2320-B-002-051-MY3] для Линь Лян в.
Materials
| Oligonucleotides | Mission Biotech (Taiwan) | ||
| phosphorothioate modified oligonucleotides | Integrated DNA Technologies (Taiwan) | ||
| DNA polymerase I, Large (Klenow) Fragment | New England Biolabs, MA | M0210L | |
| Klenow fragment (3'→5' exo-) | New England Biolabs, MA | M0212L | |
| NEBuffer 2.1 (10X) | New England Biolabs, MA | B7202S | |
| 2', 3' ddATP | Trilink Biotechnologies, CA | N4001 | |
| 2', 3' ddGTP | Trilink Biotechnologies, CA | N4002 | |
| 2', 3' ddTTP | Trilink Biotechnologies, CA | N4004 | |
| 2', 3' ddCTP | Trilink Biotechnologies, CA | N4005 | |
| dATP, dGTP, dCTP, dTTP set | Clubio, Taiwan | CB-R0315 | |
| SpectroCHIP array | Agena Bioscience, CA | #01509 | |
| MassARRAY | Agena Bioscience, CA | ||
| Typer 4.0 software | Agena Bioscience, CA | #10145 | |
| Clean Resin Tool Kit | Agena Bioscience, CA | #08040 |
Riferimenti
- Loeb, L. A., Kunkel, T. A. Fidelity of DNA synthesis. Annual Review of Biochemistry. 51, 429-457 (1982).
- Kornberg, A., Baker, T. . DNA replication. , (1992).
- Carroll, S. S., Benkovic, S. J. Mechanistic aspects of DNA polymerases: Escherichia coli DNA polymerase I (Klenow fragment) as a paradigm. Chemical Reviews. 90 (7), 1291-1307 (1990).
- Echols, H., Goodman, M. F. Fidelity Mechanisms in DNA Replication. Annual Review of Biochemistry. 60 (1), 477-511 (1991).
- Johnson, K. A. The kinetic and chemical mechanism of high-fidelity DNA polymerases. Biochimica et Biophysica Acta. 1804 (5), 1041-1048 (2010).
- Reha-Krantz, L. J. DNA polymerase proofreading: Multiple roles maintain genome stability. Biochimica et Biophysica Acta. 1804 (5), 1049-1063 (2010).
- Fidalgo da Silva, E., Reha-Krantz, L. J. DNA polymerase proofreading: active site switching catalyzed by the bacteriophage T4 DNA polymerase. Nucleic Acids Research. 35 (16), 5452-5463 (2007).
- Petruska, J., Goodman, M. F. Influence of neighboring bases on DNA polymerase insertion and proofreading fidelity. The Journal of Biological Chemistry. 260 (12), 7533-7539 (1985).
- Mendelman, L. V., Petruska, J., Goodman, M. F. Base mispair extension kinetics. Comparison of DNA polymerase α and reverse transcriptase. The Journal of Biological Chemistry. 265 (4), 2338-2346 (1990).
- Lutz, S., Burgstaller, P., Benner, S. A. An in vitro screening technique for DNA polymerases that can incorporate modified nucleotides. Pseudothymidine as a substrate for thermostable polymerases. Nucleic Acids Research. 27 (13), 2792-2798 (1999).
- Da Silva, E. F., Mandal, S. S. S., Reha-Krantz, L. J. Using 2-aminopurine fluorescence to measure incorporation of incorrect nucleotides by wild type and mutant bacteriophage T4 DNA polymerases. The Journal of Biological Chemistry. 277 (43), 40640-40649 (2002).
- Frey, M. W., Sowers, L. C., Millar, D. P., Benkovic, S. J. The nucleotide analog 2-aminopurine as a spectroscopic probe of nucleotide incorporation by the Klenow fragment of Escherichia coli polymerase I and bacteriophage T4 DNA polymerase. Biochimica. 34 (28), 9185-9192 (1995).
- Leung, K. H., et al. A highly sensitive G-quadruplex-based luminescent switch-on probe for the detection of polymerase 3′-5′ proofreading activity. Methods. 64 (3), 224-228 (2013).
- Song, C., Zhang, C., Zhao, M. Rapid and sensitive detection of DNA polymerase fidelity by singly labeled smart fluorescent probes. Biosensors and Bioelectronics. 26 (5), 2699-2702 (2011).
- Haff, L. A., Smirnov, I. P. Single-nucleotide polymorphism identification assays using a thermostable DNA polymerase and delayed extraction MALDI-TOF mass spectrometry. Genome Research. 7 (4), 378-388 (1997).
- Haff, L. A., Smirnov, I. P. Multiplex genotyping of PCR products with MassTag-labeled primers. Nucleic Acids Research. 25 (18), 3749-3750 (1997).
- Blondal, T., et al. A novel MALDI-TOF based methodology for genotyping single nucleotide polymorphisms. Nucleic Acids Research. 31 (24), e155 (2003).
- Su, K. Y., et al. Pretreatment Epidermal Growth Factor Receptor (EGFR) T790M mutation predicts shorter EGFR tyrosine kinase inhibitor response duration in patients with non-small-cell lung cancer. Journal of Clinical Oncology. 30 (4), 433-440 (2012).
- Lee, C. C., et al. Endonuclease V-mediated deoxyinosine excision repair in vitro. DNA Repair. 9, 1073-1079 (2010).
- Lee, C. C., et al. The excision of 3′ penultimate errors by DNA polymerase I and its role in endonuclease V-mediated DNA repair. DNA Repair. 12 (11), 899-911 (2013).
- Kucera, R. B., Nichols, N. M. DNA-Dependent DNA Polymerases. Current Protocols in Molecular Biology. 84 (1), 3.5.1-3.5.19 (2008).
- Tabor, S., Richardson, C. C. A single residue in DNA polymerases of the Escherichia coli DNA polymerase I family is critical for distinguishing between deoxy- and dideoxyribonucleotides. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92 (14), 6339-6343 (1995).
- Weiss, B. Removal of deoxyinosine from the Escherichia coli chromosome as studied by oligonucleotide transformation. DNA Repair. 7 (2), 205-212 (2008).
- Cao, W. Endonuclease V: an unusual enzyme for repair of DNA deamination. Cellular and Molecular Life Sciences. 70 (17), 3145-3156 (2013).
- Su, K. Y., et al. Application of single nucleotide extension and MALDI-TOF mass spectrometry in proofreading and DNA repair assay. DNA Repair. 61, 63-75 (2018).
- Carver, T. E., Hochstrasser, R. A., Millar, D. P. Proofreading DNA: recognition of aberrant DNA termini by the Klenow fragment of DNA polymerase I. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91 (22), 10670-10674 (1994).
- Santa Lucia, J., Hicks, D. The thermodynamics of DNA structural motifs. Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure. 33, 415-440 (2004).
- Su, K. Y., et al. DNA polymerase I proofreading exonuclease activity is required for endonuclease V repair pathway both in vitro and in vivo. DNA Repair. 64, 59-67 (2018).
