Revisão e ensaio de reparo de DNA usando extensão de nucleotídeo único e análise de espectrometria de massa MALDI-TOF
Summary
Foi desenvolvido um método não-rotulados, não-rádio-isótopos para revisão de DNA polimerase e um ensaio de reparo de DNA usando espectrometria de massa MALDI-TOF de alta resolução e uma estratégia de extensão de nucleotídeo único. O ensaio provou ser muito específico, simples, rápida e fácil de executar para revisão e reparação patches menor que 9-nucleotídeos.
Abstract
A manutenção do genoma e sua replicação fiel é de suma importância para a conservação de informação genética. Para avaliar a replicação de alta fidelidade, nós desenvolvemos um simples não-rotulados e análise de espectrometria (MS) para um estudo de revisão de massa não-rádio-isótopos método usando uma ionização de dessorção do laser assistida por matriz com tempo-de-voo (MALDI-TOF). Aqui, uma DNA polimerase [por exemplo, o fragmento de Klenow (KF) de Escherichia coli DNA polimerase eu (pol eu) neste estudo] na presença de todos os quatro dideoxyribonucleotide trifosfatos é usado para processar um duplex de primeira demão-modelo incompatíveis. O primer incompatível é então estendido/revisado e submetido a MALDI-TOF MS. Os produtos distinguem-se pela variação da massa do primer até variações de nucleotídeo único. Importante, uma revisão pode também ser determinado para incompatibilidades única internas, embora a diferentes eficiências. Localizado em 2-4-nucleotídeos (nt) da extremidade 3′ de incompatibilidades foram eficientemente revisado por pol eu, e um descompasso em 5 nt o terminus da primeira demão de mostrou apenas uma correção parcial. Nenhuma revisão ocorreu para incompatibilidades internas localizadas em 6-9 nt da extremidade 3′ da primeira demão. Esse método também pode ser aplicado a ensaios de reparo do DNA (por exemplo, avaliar uma reparação da base-lesão de substratos para o caminho de reparação endo V). Cartilhas contendo 3′ lesões penúltima deoxyinosine (dI) podem ser corrigidas por pol eu. Com efeito, penúltimo T-eu, G-eu e A-eu substratos tinham sua última 2 dI-contendo nucleotídeos extirpado por pol eu antes de adicionar um ddN correta 5′-monofosfato (ddNMP) enquanto o penúltimo C-eu incompatibilidades foram toleradas por pol eu, permitindo que o primer ser estendido sem reparação, demonstrando que a sensibilidade e a resolução do MS do ensaio para medir a reparação do DNA.
Introduction
As funções de revisão de polimerases de DNA durante a replicação do DNA são essenciais para garantir a alta fidelidade da informação genética que precisa ser transferido para progênie1,2,3,4, 5,6,7. Ser capaz de avaliar as contribuições da polimerase revisão se exonucleases gostaria de esclarecer os mecanismos para salvaguardar a estabilidade genética.
Radioisótopo rotulagem e ensaios baseados em gel em combinação com análises densitométricos do autoradiograms ou do fósforo de imagem8,9,10 tem sido tradicionalmente usados para detectar a atividade de revisão de DNA polimerases. Embora funcional, estes ensaios são trabalhoso, caro e não passível de formatos de alta produtividade. Além disso, radioisótopos sofrem de problemas de segurança, incluindo a eliminação de resíduos. Alternativamente, as atividades de revisão foram analisadas por técnicas fluorométrica. Por exemplo, 2-aminopurina (2-AP) pode ser incorporado em produtos de extensão durante a polimerase em vitro revisão ensaios para produzir um sinal fluorescente11,12. Infelizmente, essas abordagens sofrem uma baixa especificidade, desde 2-AP pode emparelhar com timina e citosina. Abordagens mais recentes incluem uma sensível baseados em G-quadruplex luminescente ligar sonda para um polymerase 3′ – 5′ exonuclease ensaio13 , bem como uma sonda fluorescente-etiquetadas individualmente para um polymerase revisão ensaio que supera alguns do desvantagens acima de14. Entusiasmo para esses métodos fluorométrica é diminuído devido à necessidade da rotulagem específica de substratos de DNA.
Em contraste, uma MALDI-TOF MS para análise de DNA tem sido utilizada no ensaio de PinPoint, onde as reações de extensão da primeira demão com 4 ddNTPs sem rótulo podem ser usadas para identificar polimorfismos em um determinado locus15,16,17 e foi adotado extensamente em aplicações clínicas para a detecção de mutações e câncer diagnostica18. Usando estes princípios básicos, nós criamos um rótulo livre ensaio para a determinação em vitro da DNA polimerase revisão atividade explorando a alta resolução, alta especificidade e potencial de alto rendimento de MALDI-TOF MS. usando o E. Coli DNA polimerase eu Klenow fragmento como uma enzima modelo, dideoxyribonucleotide trifosfatos (ddNTPs) como substratos podem tomar um “instantâneo” de revisão de produtos depois de um único nucleotídeo extensão através de MALDI-TOF MS (Figura 1).
Da mesma forma, este método também foi desenvolvido para um ensaio de reparo de DNA onde cartilhas contendo 3′ penúltimo dI lesões são submetidas a uma pol que reparar o ensaio que imita endo V roubada reparação intermediários. Enquanto não são totalmente conhecidas, o caminho de reparação endo V é o único sistema de reparação conhecido para empregar o pol eu revisão atividade do exonuclease para excisão de lesão19,20. Usando o MALDI-TOF MS, mostramos um remendo de reparação claramente definidos onde dI pode ser extirpado por pol eu quando ocorrem no último 2 nt do primer antes de adicionar o nucleotídeo complementado correto.
Para o estudo de revisão e reparação do ADN, este método é mais rápido e menos trabalhoso do que métodos anteriores e fornece informações adicionais para o mecanismo e função.
Protocol
Representative Results
Discussion
Este estudo descreveu um ensaio revisão passo a passo da atividade analisado pelo instrumento comercial escolhido (consulte a Tabela de materiais) usando MALDI-TOF MS. As principais vantagens incluem que o primer e o modelo são etiqueta grátis e fácil de executar, permitindo maior flexibilidade na criação de experiências. Uma fluxo-Cal completa de processamento de 30 testes de revisão levaria 4 h, incluindo 3 h para executar manualmente as correcção reações e sua limpeza, enquanto as análise…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos a facilidade do núcleo integrado NCFPB genômica funcional (Taipei, Taiwan) e o laboratório de farmacogenômica NRPB (Taipei, Taiwan) pelo apoio técnico. Este trabalho foi apoiado por bolsas de investigação da Fundação de saúde de Taiwan (L-Il) e o Ministério da ciência e tecnologia, Taipei, Taiwan, ROC [mais 105-2320-B-002-047] para Hu Wei-Yao, [mais 105-2628-B-002-051-MY3] para Su Kang-Yi e [ Most-105-2320-B-002-051-MY3] por Liang-na Lin.
Materials
| Oligonucleotides | Mission Biotech (Taiwan) | ||
| phosphorothioate modified oligonucleotides | Integrated DNA Technologies (Taiwan) | ||
| DNA polymerase I, Large (Klenow) Fragment | New England Biolabs, MA | M0210L | |
| Klenow fragment (3'→5' exo-) | New England Biolabs, MA | M0212L | |
| NEBuffer 2.1 (10X) | New England Biolabs, MA | B7202S | |
| 2', 3' ddATP | Trilink Biotechnologies, CA | N4001 | |
| 2', 3' ddGTP | Trilink Biotechnologies, CA | N4002 | |
| 2', 3' ddTTP | Trilink Biotechnologies, CA | N4004 | |
| 2', 3' ddCTP | Trilink Biotechnologies, CA | N4005 | |
| dATP, dGTP, dCTP, dTTP set | Clubio, Taiwan | CB-R0315 | |
| SpectroCHIP array | Agena Bioscience, CA | #01509 | |
| MassARRAY | Agena Bioscience, CA | ||
| Typer 4.0 software | Agena Bioscience, CA | #10145 | |
| Clean Resin Tool Kit | Agena Bioscience, CA | #08040 |
Riferimenti
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