Gaz kromatografi-kütle spektrometresi (GC-MS) Drosophila larva örnekleri hazırlanması-Metabolomics dayalı
Summary
Bu iletişim kuralı, Drosophila larva metabolomic GC-MS tabanlı analiz için hazırlamak açıklar.
Abstract
Metabolomics alanındaki son gelişmeler meyve sineği Drosophila melanogaster hayvan metabolizma çalışmak için güçlü bir genetik model olarak kurduk. Drosophila genetik araçları geniş dizi ara metabolizmasının büyük tarama alanı anket yeteneği ile birleştirerek, bir metabolomics yaklaşım diyet, genotip, hayat-tarih olayları ve çevre ipuçları arasındaki karmaşık etkileşimler ortaya çıkarabilir. Buna ek olarak, metabolomics çalışmalar roman enzimatik mekanizmaları keşfetmek ve görünüşte farklı metabolik yollar arasında daha önce bilinmeyen bağlantıları ortaya çıkarmak. Bu teknoloji Drosophila topluluk arasında daha yaygın kullanımını kolaylaştırmak için burada Drosophila larva örnekleri gaz kromatografi-kütle spektrometresi (GC-MS) için hazırlamak açıklar detaylı bir protokol sağlamak- metabolomic analizi dayalı. Bizim iletişim kuralı larva örnek koleksiyon, metaboliti ayıklama, kimyasal derivatization ve GC-MS çözümleme açıklamalarını içerir. Bu iletişim kuralı başarıyla tamamlanması amino asit, şeker ve organik asitler dahil glikoliz ve TCA döngüsü de dahil olmak üzere küçük kutup metabolitleri göreli bolluk ölçmek kullanıcılar izin verir.
Introduction
Meyve sineği Drosophila melanogaster ara metabolizma düzenleyen moleküler mekanizması eğitim için ideal bir sistem olarak ortaya çıkmıştır. Sadece çoğu metabolik yollar Drosophila ve insanlar arasında korunmuş ama anahtar besin sensörler ve büyüme düzenleyiciler, insülin, Tor ve myc, gibi aynı zamanda sinek1,2‘ aktif. Sonuç olarak, Drosophila insan hastalıkları diyabet ve obezite ateş ve kanser kadar çeşitli metabolik temeli keşfetmek için kullanılabilir. Bu bağlamda, Drosophila larva geliştirme hangi aerobik glikoliz veya Warburg etkisi olarak bilinen bir metabolik program çalışmak ideal çerçeve sağlar. Sadece birçok tümör aerobik glikoliz biyokütle karbonhidrat oluşturmak için kullanırken, öylesine Drosophila yapmak larva gelişimsel büyüme3,4,5tanıtmak için aerobik glikoliz harekete geçirmek. Bu benzerlikler arasında larva ve anlayış nasıl aerobik için anahtar bir model olarak Drosophila kurmak tümör metabolizma glikoliz düzenlenmiş vivo içindeolduğunu.
Anında metabolizma çalışmak için popüler bir model olarak ortaya çıkmıştır olmasına rağmen bireysel metabolitleri3, trehalose, trigliserid veya ATP gibi ölçmek için tasarlanmıştır yöntemleri en Drosophila çalışmaları güveniyor. Belirli bir iletişim kuralı her metaboliti ölçmek için gerekli olduğundan, tahlil tabanlı çalışmalar emek yoğun, pahalı ve ticari kitleri kullanarak ölçülen bu bileşikler karşı önyargılı vardır. Bir çözüm için bu kısıtlamalar Drosophila metabolizma eğitim daha etkili ve tarafsız bir yol sunan metabolomics alandan ortaya çıkmıştır. Tahlil tabanlı çalışmada farklı olarak, bir tek metabolomic Analizi aynı anda yüzlerce küçük molekül metabolitleri ölçebilir ve bir organizmanın metabolik durum6,7kapsamlı bir anlayış sağlamak. Bu teknik kapsamı Drosophila metabolik çalışmaların önemli ölçüde genişletti ve bu yeni ortaya çıkan alan8geleceği temsil eder.
Metabolomic çalışmalar öncelikle üç teknolojilerini kullanarak yapılır: (i) nükleer manyetik rezonans (NMR), (ii) sıvı kromatografi-kütle spektrometresi (LC-MS) ve (III) gaz kromatografi-kütle spektrometresi (GC-MS)9. Farklı avantajları ve dezavantajları her yaklaşım sunuyor ve tüm bu teknolojilerin başarıyla Drosophila metabolizma çalışmaya kullanılmıştır. Bizim laboratuarımızda yapılan araştırma üzerinde küçük, kutup metabolitleri odaklandığı öncelikle bir GC-MS tabanlı yöntemi kullanır. GC-MS birçok avantajı da dahil olmak üzere yüksek tekrarlanabilirlik, en yüksek çözünürlük, hassasiyet, kullanıcıyla sağlar ve hızlı tanımlanması için izin veren bir standart elektron etkisi (EI) spektral Kütüphane kullanılabilirliğini metabolik keşfetti Şekil10,11. Örnekleri hazırlanması için GC-MS, ancak, biraz karmaşık ve ayrıntılı bir dikkat gerektirir. Örnekleri gerekir toplanacak, yıkanmış, tartılır ve hızlı bir şekilde metabolik reaksiyonlar quenches bir şekilde dondurulmuş. Ayrıca, sinek karkas standart homojenizasyon protokolleri için dayanıklı ve en uygun metaboliti ayıklama emin olmak için bir boncuk değirmen gerektirir. Son olarak, GC-MS tarafından analiz örnekleri algılama12önce kimyasal derivatization geçmek zorundadır. Daha önce yayımlanmış yöntemleri tarif tüm bu adımları3,13,14iken, Acemi kullanıcının tekrarlanarak yüksek kalitede veri oluşturmasına olanak sağlayacak görsel iletişim kuralı hala gereklidir. Burada Drosophila larva örnekleri metabolomics GC-MS tabanlı analiz için hazırlamak nasıl gösterir. Bu iletişim kuralı tekrarlanarak birçok merkezi karbon metabolizması oluşturmak küçük kutup metabolitleri ölçmek Kullanıcı sağlar.
Protocol
Representative Results
Discussion
Metabolomics ara metabolizma oluşturmak metabolik reaksiyonları incelemek için eşsiz bir fırsat sağlar. Bu teknoloji, duyarlılığını ancak, genetik arka plan, gelişimsel ipuçları ve çevresel stresleri, sıcaklık, nem, nüfus yoğunluğu ve besin kullanılabilirliği de dahil olmak üzere çeşitli duyarlı verileri işler. Bu nedenle, bir yüksek kaliteli ve tekrarlanabilir metabolomics analiz gerektirir örnekleri son derece kontrollü koşullar altında toplanması. Burada birkaç değerlendirmeleri bu n…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Indiana Üniversitesi kütle spektroskopisi tesis ve Utah Üniversitesi Metabolomics çekirdek tesis bu iletişim kuralı en iyi duruma getirme konusunda yardım için teşekkür ederiz. J.M.T. tarafından ulusal genel tıbbi Bilimler Enstitüsü Ulusal Sağlık Enstitüleri Ödülü numarası R35GM119557 altında desteklenir.
Materials
| Unsulfured blackstrap molasses | Good Food, INC | ||
| Drosophila Agar Type II | Genesee Scientific | 66-103 | |
| Pyridine | EMD Millipore | PX2012-7 | |
| Methoxyamine hydrocholoride (MOX) | MP Biomedicals, LLC | 155405 | |
| MSTFA with 1% trimethylchlorosilane | Sigma | 69478 | |
| Fleischmann’s Active dry yeast | AB Mauri Food Inc | 2192 | |
| 6oz Drosophila stock bottle | Genesee Scientific | 32-130 | |
| Soft tissue homogenizing mix (2 mL tubes) | Omni International | SKU:19-627 | |
| Vial insert, 250 µL deactivated glass with polymer feet | Agilent | 5181-8872 | |
| Succinic acid-2,2,3,3-d4 | Sigma | 293075 | |
| SpeedVac | Thermo | SC210A | |
| o-Phosphoric acid | Fisher Scientific | A242-1 | |
| Propionic acid | Sigma | P5561 | |
| p-Hydroxy benzoic acid methyl ester | Genesee Scientific | 20-258 | |
| Bead Ruptor | Omni International | SKU:19-040E | |
| ThermoMixer F1.5 | Eppendorf | 5384000012 | |
| MultiTherm Shaker with a 24 X 12 mm block | Benchmark Scientific | H5000 | |
| Methanol | Sigma | 34860 | |
| 1.5 mL centrifuge tube | Eppendorf | 22364111 | |
| Falcon 35 X 10 mm tissue culture dish | Corning Incorporated | 353001 | |
| GC column | Phenomex | ZB-5MSi |
Riferimenti
- Owusu-Ansah, E., Perrimon, N. Modeling metabolic homeostasis and nutrient sensing in Drosophila: implications for aging and metabolic diseases. Disease Models & Mechanisms. 7 (3), 343-350 (2014).
- Sieber, M. H., Spradling, A. C. The role of metabolic states in development and disease. Current Opinion in Genetics & Development. 45, 58-68 (2017).
- Tennessen, J. M., Barry, W. E., Cox, J., Thummel, C. S. Methods for studying metabolism in Drosophila. Methods. 68 (1), 105-115 (2014).
- Li, H., et al. Drosophila larvae synthesize the putative oncometabolite L-2-hydroxyglutarate during normal developmental growth. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (6), 1353-1358 (2017).
- Tennessen, J. M., Baker, K. D., Lam, G., Evans, J., Thummel, C. S. The Drosophila Estrogen-Related Receptor Directs a Metabolic Switch that Supports Developmental Growth. Cell Metabolism. 13 (2), 139-148 (2011).
- Nicholson, J. K., Lindon, J. C., Holmes, E. Metabonomics’: understanding the metabolic responses of living systems to pathophysiological stimuli via multivariate statistical analysis of biological NMR spectroscopic data. Xenobiotica. 29 (11), 1181-1189 (1999).
- Fiehn, O. Metabolomics – the link between genotypes and phenotypes. Plant Molecular Biology. 48 (1-2), 155-171 (2002).
- Cox, J. E., Thummel, C. S., Tennessen, J. M. Metabolomic Studies in Drosophila. Genetica. 206 (3), 1169-1185 (2017).
- Lenz, E. M., Wilson, I. D. Analytical strategies in metabonomics. Journal of Proteome Research. 6 (2), 443-458 (2007).
- Pasikanti, K. K., Ho, P. C., Chan, E. C. Y. Gas chromatography/mass spectrometry in metabolic profiling of biological fluids. Journal of Chromatography B-Analytical Technologies in the Biomedical and Life Sciences. 871 (2), 202-211 (2008).
- Want, E. J., Nordstrom, A., Morita, H., Siuzdak, G. From exogenous to endogenous: The inevitable imprint of mass spectrometry in metabolomics. Journal of Proteome Research. 6 (2), 459-468 (2007).
- Garcia, A., Barbas, C., Metz, T. O. . Metabolic Profiling: Methods and Protocols Vol. 708 Methods in Molecular Biology. , 191-204 (2011).
- Chan, E. C. Y., Pasikanti, K. K., Nicholson, J. K. Global urinary metabolic profiling procedures using gas chromatography-mass spectrometry. Nature Protocols. 6 (10), 1483-1499 (2011).
- Dunn, W. B., et al. Procedures for large-scale metabolic profiling of serum and plasma using gas chromatography and liquid chromatography coupled to mass spectrometry. Nature Protocols. 6 (7), 1060-1083 (2011).
- Ashburner, M. . Drosophila: A Laboratory Manual. , 171-178 (1989).
- Biyasheva, A., Do, T. V., Lu, Y., Vaskova, M., Andres, A. J. Glue secretion in the Drosophila salivary gland: a model for steroid-regulated exocytosis. Biologia dello sviluppo. 231 (1), 234-251 (2001).
- Lommen, A. MetAlign: Interface-driven, versatile metabolomics tool for hyphenated full-scan mass spectrometry data preprocessing. Analytical Chemistry. 81 (8), 3079-3086 (2009).
- Xia, J., Wishart, D. S. Using MetaboAnalyst 3.0 for comprehensive metabolomics data analysis. Current Protocols in Bioinformatics. 55, (2016).
- Xia, J., Sinelnikov, I. V., Han, B., Wishart, D. S. MetaboAnalyst 3.0-making metabolomics more meaningful. Nucleic Acids Research. 43 (W1), W251-W257 (2015).
- Lommen, A. Data (pre-)processing of nominal and accurate mass LC-MS or GC-MS data using MetAlign. Methods in Molecular Biology. 860, 229-253 (2012).
- Xia, J., Wishart, D. S. Using MetaboAnalyst 3.0 for comprehensive metabolomics data analysis. Current Protocols in Bioinformatics. 55, (2016).
- Xia, J., Wishart, D. S. Web-based inference of biological patterns, functions and pathways from metabolomic data using MetaboAnalyst. Nature Protocols. 6 (6), 743-760 (2011).
- Li, H., Tennessen, J. M. Methods for studying the metabolic basis of Drosophila development. Wiley Interdisciplinary Reviews Developmental Biology. 6 (5), (2017).
