Preparazione di campioni larvale della drosofila per spettrometria della cromatografia-massa del Gas (GC-MS)-base di metabolomica

Moscerino della frutta Drosophila melanogaster è emerso come un sistema ideale per studiare i meccanismi molecolari che regolano il metabolismo intermedio. Non solo sono la maggior parte delle vie metaboliche conservate tra Drosophila e gli esseri umani, ma nutrienti chiave sensori e regolatori di crescita, come l’insulina, Tor e myc, sono anche attivi in volare^1,2. Di conseguenza, Drosophila consente di esplorare la base metabolica delle malattie umane che vanno dal diabete e obesità a neurodegenerazione e cancro. A questo proposito, lo sviluppo larvale della drosofila fornisce il quadro ideale in cui studiare un programma metabolico conosciuto come glicolisi aerobica, o l’effetto di Warburg. Proprio come molti tumori utilizzano la glicolisi aerobica per generare biomassa da carboidrati, così per fare della drosofila larve attivano glicolisi aerobica per promuovere la crescita dello sviluppo^3,4,5. Queste somiglianze tra larvale e metabolismo del tumore stabilire Drosophila come modello chiave per la comprensione come aerobico glicolisi è regolamentato in vivo.

Nonostante il fatto che la Mosca è emerso come un modello popolare per studiare il metabolismo, la maggior parte degli studi di Drosophila si basano su metodi che sono progettati per misurare diversi metaboliti³, quali trealosio, trigliceridi o ATP. Poiché un protocollo specifico è necessaria per misurare ogni metabolita, studi basati su analisi sono laboriosi, costoso e prevenuto verso quei composti che possono essere misurati usando i kit commerciali. Una soluzione a queste limitazioni è emerso dal campo della metabolomica, che fornisce un mezzo più efficiente ed imparziale di studiare il metabolismo di Drosophila . A differenza di uno studio basato su analisi, un’analisi metabolomica singolo può simultaneamente misurare centinaia di piccole molecole metaboliti e fornire una comprensione globale di stato metabolico^{6,7 di un organismo}. Questa tecnica ha notevolmente ampliato il campo di studi metabolici di Drosophila e rappresenta il futuro di questo settore emergente⁸.

Metabolomica studi vengono condotti principalmente utilizzando tre tecnologie: (i) risonanza magnetica nucleare (NMR), (ii) liquida spettrometria della cromatografia-massa (LC-MS) e (iii) gas cromatografia-spettrometria (GC-MS)⁹. Ogni approccio offre vantaggi e svantaggi, e tutte queste tecnologie sono state usate per studiare con successo metabolismo di Drosophila . Poiché le ricerche condotte nel nostro laboratorio sono focalizzata sui metaboliti polari, piccoli, principalmente ci avvaliamo di un metodo basato su GC-MS. GC-MS fornisce all’utente una serie di vantaggi, tra cui alta riproducibilità, risoluzione dei picchi, sensibilità, e la disponibilità di una libreria spettrale di impatto (EI) standard dell’elettrone, che permette la rapida identificazione di scoperto metabolica caratteristiche^10,11. La preparazione dei campioni per GC-MS, tuttavia, è piuttosto complessa e richiede una grande attenzione al dettaglio. Campioni devono essere raccolto, lavati, pesati e congelati in un modo che disseta rapidamente reazioni metaboliche. Inoltre, la carcassa Vola è resistente ai protocolli standard omogeneizzazione e richiede un mulino di tallone per assicurare l’estrazione ottimale del metabolita. Infine, i campioni analizzati mediante GC-MS devono subire derivatizzazione chimica prima del rilevamento¹². Mentre precedentemente pubblicati metodi descrivono tutti questi passaggi^3,13,14, è ancora necessario un protocollo visual che consentirebbe l’utente inesperto di riproducibile generare dati di alta qualità. Qui dimostriamo come preparare Drosophila larvali campioni per l’analisi metabolomica basati su GC-MS. Questo protocollo permette all’utente di misurare riproducibile molti dei piccoli metaboliti polari che compongono il metabolismo del carbonio centrale.