Подготовка дрозофилы личиночной образцов для газовой хроматографии масс-спектрометрии (ГХ МС)-на основе Метаболомика
Summary
Этот протокол описывает, как подготовить для анализа на базе GC-MS Метаболомные дрозофилы личинки.
Abstract
Последние достижения в области метаболомики создали плодовой мушки Drosophila melanogaster как мощный генетическая модель для изучения животных метаболизма. Объединив широкий спектр дрозофилы генетических инструментов с возможностью обследования крупных swaths посреднических метаболизма, метаболомики подход может выявить сложные взаимодействия между диета, генотип, события истории жизни и экологические сигналы. Кроме того метаболомики исследования можно обнаружить роман ферментативные механизмов и раскрыть ранее неизвестные соединения между казалось бы различных метаболических путей. Для того, чтобы содействовать более широкому использованию этой технологии среди сообщества дрозофилы , здесь мы предоставляем подробный протокол, который описывается, как подготовить дрозофилы личиночной образцы для газовой хроматографии масс-спектрометрии (ГХ-МС)- на основе анализа Метаболомные. Наш протокол включает описание личинок проб, экстракции метаболитов, химические деривации и GC-MS анализа. Успешное завершение этого протокола позволит пользователям измерить относительное обилие небольших полярных метаболитов, включая аминокислоты, сахара и органические кислоты участвуют в гликолизе и ТСА циклов.
Introduction
Плодовой мушки Drosophila melanogaster стала идеальной системы для изучения молекулярный механизм, который регулировал промежуточный метаболизм. Не только большинство метаболических консервируют между дрозофилы и людьми, но ключевых питательных датчики и регуляторы роста, такие как инсулин, Tor и myc, также активны в лету1,2. В результате дрозофилы может использоваться для изучения метаболизма основу заболеваний человека, начиная от диабета и ожирения нейродегенеративные и рака. В этой связи развития личинок дрозофилы предоставляет идеальные рамки для изучения метаболизма программа, известная как аэробного гликолиза, или Варбург эффект. Так же, как многие опухоли использовать аэробного гликолиза для создания биомассы из углеводов, так что делать дрозофилы личинки активировать аэробного гликолиза для поощрения развития роста3,4,5. Эти сходства между личинок и опухоли метаболизм установить дрозофилы как модель для понимания как аэробного гликолиза, регулируемых в естественных условиях.
Несмотря на тот факт, что лету стала популярная модель для изучения метаболизма большинство исследований дрозофилы полагаются на методы, которые предназначены для измерения отдельных метаболитов3, например, Трегалоза, триглицеридов или СПС. Поскольку конкретный протокол необходим для измерения каждого метаболит, на основе анализа исследований трудоемкий, дорого и предвзятым по отношению к тех соединений, которые могут быть измерены с помощью коммерческих комплектов. Решение этих ограничений возникла из поля метаболомики, который обеспечивает более эффективное и объективное средства изучения метаболизма дрозофилы . В отличие от исследования, на основе анализа анализ одного Метаболомные может одновременно измерять сотни малых молекул метаболитов и обеспечить полное понимание организма метаболический статус6,7. Этот метод значительно расширил сферу исследований метаболизма дрозофилы и представляет будущее этой формирующейся поле8.
Метаболомные исследования проводятся главным образом с помощью трех технологий: (i) ядерного магнитного резонанса (ЯМР), (ii) жидкие хроматография масс-спектрометрия (LC-MS) и9(iii) газовой хроматографии масс-спектрометрии (ГХ-МС). Каждый подход имеет свои преимущества и недостатки, и все эти технологии были использованы для успешного изучения метаболизма дрозофилы . Поскольку исследования, проведенные в нашей лаборатории ориентирована на небольшие, полярные метаболиты, мы прежде всего использовать метод, основанный на GC-MS. GC-MS предоставляет пользователю целый ряд преимуществ, включая высокую воспроизводимость, пик разрешение, чувствительность, и доступность стандартных электрона воздействия (EI) спектральных библиотеки, который позволяет для быстрой идентификации обнаружил метаболических особенности10,11. Подготовка образцов для ГХ-МС, однако, является довольно сложной и требует пристального внимания к деталям. Образцы должны быть собраны, промывают, весил и заморожены в манере, которая быстро утоляет метаболических реакций. Кроме того весь каркас устойчив к гомогенизации стандартных протоколов и требует бисерная мельница для обеспечения оптимального метаболит добычи. Наконец образцы анализируемой GC-MS должны пройти химический деривации до обнаружения12. В то время как ранее опубликованные методы описывают все эти шаги3,13,14, визуальный протокол, который позволит начинающего пользователя можно воспроизвести создавать высококачественные данные по-прежнему необходима. Здесь мы продемонстрируем подготовить дрозофилы личиночной образцы для анализа на базе GC-MS метаболомики. Этот протокол позволяет пользователю можно воспроизвести измеряют многие из небольших полярных метаболитов, которые составляют центральный углерода метаболизм.
Protocol
Representative Results
Discussion
Метаболомика предоставляет беспрецедентную возможность для обследования метаболических реакций, которые составляют промежуточный метаболизм. Чувствительность этой технологии, однако, отображает данные подвержены генетический фон, развития подсказки и разнообразные экологическог…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Спасибо для членов Фонда спектроскопии массы университета Индианы и Университет Юты метаболомики Core фонда для оказания помощи в оптимизации этого протокола. СГН поддерживается путем национального института Генеральной медицинских наук национальных институтов здоровья под награду номер R35GM119557.
Materials
| Unsulfured blackstrap molasses | Good Food, INC | ||
| Drosophila Agar Type II | Genesee Scientific | 66-103 | |
| Pyridine | EMD Millipore | PX2012-7 | |
| Methoxyamine hydrocholoride (MOX) | MP Biomedicals, LLC | 155405 | |
| MSTFA with 1% trimethylchlorosilane | Sigma | 69478 | |
| Fleischmann’s Active dry yeast | AB Mauri Food Inc | 2192 | |
| 6oz Drosophila stock bottle | Genesee Scientific | 32-130 | |
| Soft tissue homogenizing mix (2 mL tubes) | Omni International | SKU:19-627 | |
| Vial insert, 250 µL deactivated glass with polymer feet | Agilent | 5181-8872 | |
| Succinic acid-2,2,3,3-d4 | Sigma | 293075 | |
| SpeedVac | Thermo | SC210A | |
| o-Phosphoric acid | Fisher Scientific | A242-1 | |
| Propionic acid | Sigma | P5561 | |
| p-Hydroxy benzoic acid methyl ester | Genesee Scientific | 20-258 | |
| Bead Ruptor | Omni International | SKU:19-040E | |
| ThermoMixer F1.5 | Eppendorf | 5384000012 | |
| MultiTherm Shaker with a 24 X 12 mm block | Benchmark Scientific | H5000 | |
| Methanol | Sigma | 34860 | |
| 1.5 mL centrifuge tube | Eppendorf | 22364111 | |
| Falcon 35 X 10 mm tissue culture dish | Corning Incorporated | 353001 | |
| GC column | Phenomex | ZB-5MSi |
Riferimenti
- Owusu-Ansah, E., Perrimon, N. Modeling metabolic homeostasis and nutrient sensing in Drosophila: implications for aging and metabolic diseases. Disease Models & Mechanisms. 7 (3), 343-350 (2014).
- Sieber, M. H., Spradling, A. C. The role of metabolic states in development and disease. Current Opinion in Genetics & Development. 45, 58-68 (2017).
- Tennessen, J. M., Barry, W. E., Cox, J., Thummel, C. S. Methods for studying metabolism in Drosophila. Methods. 68 (1), 105-115 (2014).
- Li, H., et al. Drosophila larvae synthesize the putative oncometabolite L-2-hydroxyglutarate during normal developmental growth. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (6), 1353-1358 (2017).
- Tennessen, J. M., Baker, K. D., Lam, G., Evans, J., Thummel, C. S. The Drosophila Estrogen-Related Receptor Directs a Metabolic Switch that Supports Developmental Growth. Cell Metabolism. 13 (2), 139-148 (2011).
- Nicholson, J. K., Lindon, J. C., Holmes, E. Metabonomics’: understanding the metabolic responses of living systems to pathophysiological stimuli via multivariate statistical analysis of biological NMR spectroscopic data. Xenobiotica. 29 (11), 1181-1189 (1999).
- Fiehn, O. Metabolomics – the link between genotypes and phenotypes. Plant Molecular Biology. 48 (1-2), 155-171 (2002).
- Cox, J. E., Thummel, C. S., Tennessen, J. M. Metabolomic Studies in Drosophila. Genetica. 206 (3), 1169-1185 (2017).
- Lenz, E. M., Wilson, I. D. Analytical strategies in metabonomics. Journal of Proteome Research. 6 (2), 443-458 (2007).
- Pasikanti, K. K., Ho, P. C., Chan, E. C. Y. Gas chromatography/mass spectrometry in metabolic profiling of biological fluids. Journal of Chromatography B-Analytical Technologies in the Biomedical and Life Sciences. 871 (2), 202-211 (2008).
- Want, E. J., Nordstrom, A., Morita, H., Siuzdak, G. From exogenous to endogenous: The inevitable imprint of mass spectrometry in metabolomics. Journal of Proteome Research. 6 (2), 459-468 (2007).
- Garcia, A., Barbas, C., Metz, T. O. . Metabolic Profiling: Methods and Protocols Vol. 708 Methods in Molecular Biology. , 191-204 (2011).
- Chan, E. C. Y., Pasikanti, K. K., Nicholson, J. K. Global urinary metabolic profiling procedures using gas chromatography-mass spectrometry. Nature Protocols. 6 (10), 1483-1499 (2011).
- Dunn, W. B., et al. Procedures for large-scale metabolic profiling of serum and plasma using gas chromatography and liquid chromatography coupled to mass spectrometry. Nature Protocols. 6 (7), 1060-1083 (2011).
- Ashburner, M. . Drosophila: A Laboratory Manual. , 171-178 (1989).
- Biyasheva, A., Do, T. V., Lu, Y., Vaskova, M., Andres, A. J. Glue secretion in the Drosophila salivary gland: a model for steroid-regulated exocytosis. Biologia dello sviluppo. 231 (1), 234-251 (2001).
- Lommen, A. MetAlign: Interface-driven, versatile metabolomics tool for hyphenated full-scan mass spectrometry data preprocessing. Analytical Chemistry. 81 (8), 3079-3086 (2009).
- Xia, J., Wishart, D. S. Using MetaboAnalyst 3.0 for comprehensive metabolomics data analysis. Current Protocols in Bioinformatics. 55, (2016).
- Xia, J., Sinelnikov, I. V., Han, B., Wishart, D. S. MetaboAnalyst 3.0-making metabolomics more meaningful. Nucleic Acids Research. 43 (W1), W251-W257 (2015).
- Lommen, A. Data (pre-)processing of nominal and accurate mass LC-MS or GC-MS data using MetAlign. Methods in Molecular Biology. 860, 229-253 (2012).
- Xia, J., Wishart, D. S. Using MetaboAnalyst 3.0 for comprehensive metabolomics data analysis. Current Protocols in Bioinformatics. 55, (2016).
- Xia, J., Wishart, D. S. Web-based inference of biological patterns, functions and pathways from metabolomic data using MetaboAnalyst. Nature Protocols. 6 (6), 743-760 (2011).
- Li, H., Tennessen, J. M. Methods for studying the metabolic basis of Drosophila development. Wiley Interdisciplinary Reviews Developmental Biology. 6 (5), (2017).
