Préparation des échantillons de larves de drosophile pour chromatographie en phase gazeuse-spectrométrie de masse (GC-MS)-base de métabolomique
Summary
Ce protocole décrit comment préparer des larves de drosophile pour analyse métabolomique basée sur GC-MS.
Abstract
Les progrès récents dans le domaine de la métabolomique ont établi la drosophile Drosophila melanogaster comme un puissant modèle génétique pour étudier le métabolisme des animaux. En combinant la vaste gamme d’outils génétiques drosophile avec la possibilité d’arpenter les grandes étendues du métabolisme intermédiaire, une approche métabolomique peut révéler des interactions complexes entre diet, génotype, événements démographiques et des signaux environnementaux. En outre, les études métabolomiques peuvent découvrir de nouveaux mécanismes enzymatiques et découvrir jusque-là inconnues des connexions entre les voies métaboliques apparemment disparates. Afin de faciliter une utilisation plus répandue de cette technologie auprès de la communauté de drosophile , ici, nous fournissons un protocole détaillé qui décrit comment préparer des échantillons de larves de drosophile pour chromatographie en phase gazeuse-spectrométrie de masse (GC-MS)- base d’analyse de la métabolomique. Notre protocole inclut des descriptions de prélèvement d’échantillons de larves, d’extraction de métabolite, dérivatisation chimique et analyse par CPG-SM. La réussite de ce protocole permettra aux utilisateurs de mesurer l’abondance relative des petits métabolites polaires, y compris les acides aminés, sucres et acides organiques impliqués dans la glycolyse et les cycles TCA.
Introduction
La drosophile Drosophila melanogaster est apparu comme un système idéal pour étudier les mécanismes moléculaires qui régulent le métabolisme intermédiaire. Non seulement la plupart des voies métaboliques conservées entre la drosophile et les humains, mais capteurs en éléments nutritifs principaux et régulateurs de croissance, comme l’insuline, Tor et myc, sont également actifs dans la mouche1,2. En conséquence, drosophile peut servir à explorer la base métabolique de maladies allant du diabète et l’obésité neurodégénérescence et du cancer. À cet égard, le développement larvaire de Drosophila offre le cadre idéal étudier un programme métabolique appelé glycolyse aérobie, ou l’effet Warburg. A l’instar de plusieurs tumeurs utilisent glycolyse aérobie pour générer la biomasse provenant des glucides, donc pour faire Drosophila larves activent la glycolyse aérobie afin de promouvoir la croissance du développement3,4,5. Ces similitudes entre les larves et le métabolisme de tumeur établir la drosophile comme modèle clé pour comprendre comment aérobie glycolyse est réglementé en vivo.
Malgré le fait que la mouche s’est imposé comme un modèle populaire pour étudier le métabolisme, la plupart des études de drosophile s’appuient sur des méthodes qui sont conçus pour mesurer différents métabolites3, tels que le tréhalose, triglycérides ou ATP. Puisqu’un protocole spécifique est requise pour mesurer chaque métabolite, études sur le dosage sont fastidieux, coûteux et préjugé en faveur de ces composés qui peuvent être mesurés à l’aide de trousses commerciales. Une solution à ces limitations a émergé dans le domaine de la métabolomique, qui fournit un moyen plus efficace et impartial d’étudier le métabolisme de la drosophile . Contrairement à une étude axée sur l’analyse, une analyse unique métabolomique peut simultanément mesure des centaines de métabolites de petites molécules et fournit une compréhension globale de l’organisme un état métabolique6,7. Cette technique a considérablement élargi la portée des études métaboliques de drosophile et représente l’avenir de ce nouveau champ8.
Métabolomique sont principalement menées à l’aide de trois technologies : (i) résonance magnétique nucléaire (RMN), (ii) liquide chromatographie spectrométrie de masse (LC-MS) et (iii) chromatographie en phase gazeuse-spectrométrie de masse (GC-MS)9. Chaque approche propose des inconvénients et des avantages distincts, et toutes ces technologies ont été utilisées pour étudier avec succès le métabolisme de drosophile . Étant donné que les recherches effectuées dans notre laboratoire se concentre sur les métabolites petits, polaires, nous utilisons principalement une méthode basée sur le GC-MS. GC-MS fournit à l’utilisateur avec un certain nombre d’avantages, notamment une grande reproductibilité, résolution maximale, la sensibilité, et de la disponibilité d’une bibliothèque spectrale standard electron impact (IE), qui permet l’identification rapide des découvertes métabolique caractéristiques10,11. La préparation des échantillons pour GC-MS, cependant, est quelque peu complexe et nécessite une attention minutieuse aux détails. Échantillons doivent être recueillies, lavés, pesés et congelés d’une manière qui apaise rapidement les réactions métaboliques. En outre, la carcasse mouche résiste aux protocoles standard de l’homogénéisation et nécessite un moulin à billes afin d’assurer l’extraction optimale de métabolite. Enfin, les échantillons analysés par GC-MS doivent subir dérivatisation chimique avant la détection12. Alors que les méthodes publiées antérieurement décrivent toutes ces étapes de13,3,14, un protocole visuel qui permettrait à l’utilisateur novice de façon reproductible générer des données de haute qualité est encore nécessaire. Nous démontrons comment préparer des échantillons de larves de drosophile pour analyse métabolomique basée sur GC-MS. Ce protocole permet à l’utilisateur de façon reproductible mesurer beaucoup des petits métabolites polaires qui composent le métabolisme carboné central.
Protocol
Representative Results
Discussion
Métabolomique fournit une occasion sans pareille d’arpenter les réactions métaboliques qui composent le métabolisme intermédiaire. La sensibilité de cette technologie, toutefois, restitue des données sensibles au bagage génétique, les indices du développement et une variété de contraintes environnementales, y compris la température, l’humidité, la densité de population et la disponibilité des nutriments. Par conséquent, une haute qualité et reproductibles métabolomique analyse exige que les échant…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Merci aux membres de la Indiana University Mass Spectroscopy Facility et l’Université de l’Utah métabolomique Core Facility d’assistance dans l’optimisation de ce protocole. J.M.T. est pris en charge par le National Institute of General Medical Sciences, de la National Institutes of Health, sous attribution numéro R35GM119557.
Materials
| Unsulfured blackstrap molasses | Good Food, INC | ||
| Drosophila Agar Type II | Genesee Scientific | 66-103 | |
| Pyridine | EMD Millipore | PX2012-7 | |
| Methoxyamine hydrocholoride (MOX) | MP Biomedicals, LLC | 155405 | |
| MSTFA with 1% trimethylchlorosilane | Sigma | 69478 | |
| Fleischmann’s Active dry yeast | AB Mauri Food Inc | 2192 | |
| 6oz Drosophila stock bottle | Genesee Scientific | 32-130 | |
| Soft tissue homogenizing mix (2 mL tubes) | Omni International | SKU:19-627 | |
| Vial insert, 250 µL deactivated glass with polymer feet | Agilent | 5181-8872 | |
| Succinic acid-2,2,3,3-d4 | Sigma | 293075 | |
| SpeedVac | Thermo | SC210A | |
| o-Phosphoric acid | Fisher Scientific | A242-1 | |
| Propionic acid | Sigma | P5561 | |
| p-Hydroxy benzoic acid methyl ester | Genesee Scientific | 20-258 | |
| Bead Ruptor | Omni International | SKU:19-040E | |
| ThermoMixer F1.5 | Eppendorf | 5384000012 | |
| MultiTherm Shaker with a 24 X 12 mm block | Benchmark Scientific | H5000 | |
| Methanol | Sigma | 34860 | |
| 1.5 mL centrifuge tube | Eppendorf | 22364111 | |
| Falcon 35 X 10 mm tissue culture dish | Corning Incorporated | 353001 | |
| GC column | Phenomex | ZB-5MSi |
Riferimenti
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