Voorbereiding van Drosophila larvale monsters van gaschromatografie-massaspectrometrie (GC-MS)-gebaseerd metabolomica

De fruitvlieg Drosophila melanogaster heeft ontpopt als een ideaal systeem voor het bestuderen van het moleculaire mechanisme dat tussenliggende metabolisme reguleren. Niet alleen zijn de meeste stofwisselingsroutes bewaard tussen Drosophila en de mens, maar ook belangrijke nutriënten sensoren en groeiregulatoren, zoals insuline, Tor en myc, zijn actief in de vliegen^1,2. Dientengevolge, kan Drosophila worden gebruikt om te verkennen de metabole basis van ziekten bij de mens variërend van diabetes en obesitas tot neurodegeneratie en kanker. In dit verband biedt Drosophila larvale ontwikkeling het ideale kader om te bestuderen van een metabole programma genoemd aërobe glycolyse, of het Warburg effect. Net zoals veel tumoren aërobe glycolyse gebruiken biomassa genereren uit koolhydraten, dus activeren hiervoor Drosophila larven aërobe glycolyse ter bevordering van de ontwikkelingstoxiciteit groei^3,4,5. Deze overeenkomsten tussen larvale en tumor metabolisme Drosophila vast te stellen als een belangrijke model om te begrijpen hoe aërobe glycolyse is gereglementeerde in vivo.

Ondanks het feit dat de vlieg heeft ontpopt als een populair model voor het bestuderen van de stofwisseling, vertrouwen meeste Drosophila studies op methoden die zijn ontworpen voor het meten van individuele metabolieten³, zoals trehalose, triglyceriden of ATP. Aangezien een specifiek protocol vereist is voor het meten van elk metaboliet, zijn assay gebaseerde studies arbeidsintensief, duur en bevooroordeeld naar deze verbindingen die kunnen worden gemeten met behulp van commerciële kits. Een oplossing voor deze beperkingen is gebleken uit het veld van metabolomica, waarmee een meer efficiënte en onpartijdige middel van het bestuderen van Drosophila metabolisme. In tegenstelling tot een kwantitatieve analyse gebaseerde studie, kan een analyse van één metabolomic tegelijk meten van honderden kleine molecuul metabolieten en bieden een grondig inzicht in een organisme van metabole status^6,7. Deze techniek heeft het toepassingsgebied van Drosophila metabole studies aanzienlijk uitgebreid en vertegenwoordigt de toekomst van deze opkomende veld⁸.

Metabolomic onderzoeken worden hoofdzakelijk uitgevoerd met behulp van drie technologieën: (i) nucleaire magnetische resonantie (NMR), (ii) de vloeibare chromatografie-massaspectrometrie (LC-MS), en (iii) verlenging van het gaschromatografie-massaspectrometrie (GC-MS)⁹. Elke benadering biedt verschillende voordelen en nadelen, en alle van deze technologieën zijn gebruikt om succesvol studeren Drosophila metabolisme. Aangezien het onderzoek uitgevoerd in ons lab is gericht op kleine, polar metabolieten, we gebruiken voornamelijk een op basis van GC-MS methode. GC-MS biedt de gebruiker met een aantal voordelen, waaronder hoge reproduceerbaarheid, de resolutie van de piek, de gevoeligheid, en de beschikbaarheid van een standaard elektron effect (EI) spectrale bibliotheek, die het mogelijk voor de snelle identificatie van maakt metabole ontdekt functies^10,11. De bereiding van de monsters voor de GC-MS, echter, is enigszins complex en vereist een zorgvuldige aandacht voor detail. Monsters worden verzameld, gewassen, gewogen, en bevroren op een wijze die snel metabole reacties lest. Bovendien, het vliegen karkas is resistent tegen standaard homogenisering protocollen en vereist een kraal molen om optimale metaboliet extractie. Tot slot moeten monsters geanalyseerd door GC-MS chemische bewerking vóór detectie¹²ondergaan. Terwijl eerder gepubliceerde methoden elk van deze stappen^{3,13,14 beschrijven}, is nog steeds een visuele protocol dat zou de beginnende gebruiker reproducibly het genereren van hoge kwaliteit gegevens nodig. Hier laten we zien hoe Drosophila larvale monsters om voor te bereiden op basis van GC-MS metabolomica analyse. Dit protocol kan de gebruiker reproducibly veel van de kleine polar metabolieten, waaruit de centrale koolstof metabolisme te meten.