Определение Hsp33 в редокс регулируемых Chaperone активность и сопоставления конформационные изменения на Hsp33 с использованием водорода дейтерия обмен масс-спектрометрия

Клетки часто сталкиваются накопление реактивнооксигенных видов (ров) производится как побочные продукты дыхания^1,2, белков и липидов окисления^3,4и дополнительные процессы^{5, 6,7}. Несмотря на РОСИ благотворную роль в различных биологических процессах, таких как сотовые сигнализации^8,9 и иммунный ответ¹⁰дисбаланс между производством рос и его детоксикации может произойти, ведущих к окислительным подчеркнуть⁷. Биологической цели ROS являются белки, липиды и нуклеиновые кислоты, окисления, которые влияют на их структуру и функции. Таким образом накопление сотовой окислителей тесно связан с разнообразных патологий, включая рак^9,11, воспаление^12,13и старения^{14, 15}и были найдены в наступление и прогрессии нейродегенеративных расстройств, таких как Альцгеймера, Паркинсона и ALS болезнь^16,17,18.

Недавно синтезированных и зрелые белки очень чувствительны к окислению ввиду потенциально опасные изменения их боковых цепей, которые формируют протеин структуры и функции^19,20. Таким образом Оксидативный стресс обычно приводит к инактивации широко белка, сворачиванию и агрегирования, в конечном итоге приводит к смерти клетки. Один из элегантных сотовой стратегии, чтобы справиться с потенциальным ущербом окисление белков является использовать редокс зависимых сопровождающих, которые препятствуют широко белка агрегации, вместо формирования стабильные комплексы с клиента смятых протеинов^{21 ,,22}–²³. Эти первой линии обороны сопровождающих быстро активируются по участкам окисления (обычно на остатков цистеина), который преобразует их в мощный анти агрегирование молекул²⁴. Так как Оксидативный стресс приводит в угнетение дыхания и уменьшается в клеточных уровни ATP²⁵, каноническое АТФ зависимые сопровождающих являются менее эффективными при окислительном стрессе условий^{25,26 ,27}. Таким образом, редокс активации АТФ независимые сопровождающих играют жизненно важную роль в поддержании гомеостаза белка после накопления окислителей в бактерий и эукариот (например, Hsp33²⁸ и²⁹ Рида в бактерии, Get3³⁰ в peroxiredoxins³¹ в клетках эукариот: у дрожжей). Деятельность этих сопровождающих сильно зависит от реверсивные конформационные структурных изменений, вызванных участкам окисления, что раскрывает гидрофобные регионы вовлеченных в признании клиента смятых протеинов.

Исследование механизма борьбы с агрегации и принципы, регулирующие признание клиента белков, сопровождающих не легко из-за динамичного и разнообразного характера шаперонов субстрат взаимодействия^{32,33, 34,35,,3637}. Однако, стресс регулируется сопровождающим имеют возможность для продвижения нашего понимания анти статистическую функцию из-за их способность: 1) получить две различные формы сопровождающий, активно (например, окисляется) и неактивных (например, сокращены), с введения или удаления состояния стресса, легко переключаться между ними (например, окислителя и восстановителя), 2) имеют широкий спектр субстратов, 3) образуют весьма стабильные комплексы с клиента белков, которые могут быть оценены различные структурные методологии и 4) сосредоточиться исключительно на признания субстрата и релиз, посредничестве редокс зависимых конформационные изменения, как большинство из этих сопровождающих не хватает складной возможности.

Здесь мы анализируем бактериальных редокс регулируемых сопровождающий Hsp33 в борьбе с агрегационной активности, жизненно важным компонентом системы бактериальной обороны против окисления индуцированного белка агрегации²⁸. При уменьшении Hsp33 это плотно сложенный цинка связывающий белок с без сопровождения деятельности; Однако когда подвергается окислительному стрессу, Hsp33 проходит обширные конформационные изменения, которые предоставляют его субстрат привязки регионов^38,39. После окисления иона цинка, который сильно привязан к четыре высоко сохранены хвоща остатков домена C-терминала — выпустила⁴⁰. Это приводит к образованию двумя дисульфидными облигаций, разворачивается домен C-терминала и дестабилизации соседних компоновщика региона⁴¹. C-терминала и компоновщик регионы являются очень гибкими и определяются как частично или внутренне неупорядоченным. По возвращении в не стрессовых условиях которым стало сокращение и шаперонов возвращается в свой родной сложенном состоянии с не анти агрегационной активности. Складывая шаперонов приводит к дальнейшей разворачивается и дестабилизации белка присоединенного клиента, который вызывает его передачи канонической сопровождения системы, DnaK/J, складывая³⁸. Анализ сайтов взаимодействия Hsp33 и предполагает, что Hsp33 использует оба его заряженных неупорядоченных регионов, а также гидрофобные регионов на компоновщик и N-концевой домен для захвата денатурации белков клиента и предотвратить их агрегации^{38, 42}. в сложенном состоянии, эти регионы являются скрытыми сложенном компоновщик и домен C-терминала. Интересно, что компоновщик региона служит привратник Hsp33 в сложенном и неактивные государства, «зондирования» складной статус его рядом C-терминала домен³⁴. Когда дестабилизирована мутагенеза, (либо Точечная мутация или полной последовательности возмущений), Hsp33 преобразуется в конститутивно активных сопровождающий независимо окислительно-восстановительного состояния его редокс чувствительных к которым⁴³.

Здесь представлены протоколы позволяют мониторинг Hsp33 в редокс зависимых сопровождения деятельности, а также картирование конформационные изменения после активации и привязка клиента белков. Эта методология может быть адаптирована для исследования других шаперонов клиент признание моделей, а также не сопровождающий белок белковых взаимодействий. Кроме того мы представляем протоколы для подготовки полностью восстановленного и окисленного сопровождающих, которые могут использоваться в исследованиях других белков редокс переключатель, чтобы выявить потенциальную роль окисление белков на активность белка.

В частности, мы описывают процедуру мониторинга сопровождения деятельности в пробирке и определить его субстратная специфичность под различные типы агрегации белков (химически и термически индуцированной) рассеяния света (LS) измеряется с помощью fluorospectrometer⁴⁴. В ходе статистической обработки рассеяние света на 360 Нм увеличивается быстро из-за увеличения мутность. Таким образом в зависимости от времени на этой длине волны может контролироваться агрегации. LS — это быстрый и чувствительных метод для тестирования агрегации белков и, таким образом, анти агрегационной активности белка интерес с помощью наномолярных концентрациях, позволяя характеристику белков связанных с агрегации кинетических параметров при различных условий. Кроме того протокол LS, описанный здесь не требуют дорогостоящей аппаратуры и может быть легко устанавливается в любой лаборатории.

Тем не менее это довольно сложной задачей для получения «чистой» кинетических кривых и получения белка кинетических параметров от таких светорассеянию эксперименты, из-за шума и большое количество промахов, порожденных пузырьки воздуха и крупных агрегатов. Чтобы преодолеть это препятствие, мы представляем новый графический инструмент, Kfits⁴⁵, используется для снижения уровня шума в разных Кинетические измерения, специально приспособлены для белка агрегации кинетических данных. Это программное обеспечение обеспечивает предварительные кинетические параметры для ранней оценки результатов и позволяет пользователю «чистых» больших объемов данных быстро не затрагивая его кинетические свойства. Kfits , реализованных в Python и доступны в открытым исходным кодом на ⁴⁵.

Один из сложных вопросов в области относится сопоставление сайтов взаимодействия между их клиент белков и сопровождающих и понимания, как сопровождающим признать широкий спектр смятых субстратов. Этот вопрос далее осложняется, когда изучение высокодинамичные белковых комплексов, которые неразрывно связаны неупорядоченных сопровождающих и подверженных агрегации субстратов. К счастью структурные масс-спектрометрии значительно продвинулась в течение последнего десятилетия и успешно оказывает полезные подходы и инструменты для анализа структурных пластичности и карта остатков занимающихся белка признание^{46, 47 , 48 , 49}. здесь, мы представляем один такой техники водород дейтерий обмен масс-спектрометрии (HDX-МС)-которая позволяет отображение остаточного уровня изменения в структурной конформации белка модификации или белка/лигандом привязки^{35, 50,51,52,53,54,55}. HDX-MS использует непрерывного обмена водороды позвоночника от дейтерия, уровень которой зависит от химической среды, доступность, и ковалентных и ковалентные связи⁵⁶. HDX-MS отслеживает эти обменные процессы, с помощью транс растворителя, часто тяжелой воды (D₂O) и позволяет измерения, основанные на изменении молекулярной массой после водорода дейтерия обмена. Замедление темпов обмена водорода дейтерия может привести от водороды участвующих в водородных связей или, просто, от их пространственной помех, который показывает локальных изменений в структуре⁵⁷. Изменения на Связывание лиганда или столб-поступательные изменения также могут привести к различия в среде водорода с помощью привязки, что привело к различиям в водорода дейтерия обмен (HDX) ставки^46,53.

Мы применили эту технологию к 1) карта Hsp33 регионов, которые быстро разворачиваться после окисления, приводит к активации Hsp33 и 2) определить потенциальные привязки интерфейс Hsp33 с его полнометражный смятых субстрата, цитрат синтазы (CS)³⁸.

Методы, описанные в этой рукописи могут применяться к исследованию редокс зависимые функции белков в пробирке, определение анти агрегационной активности и роль структурных изменений (если таковые имеются) в функции протеина. Эти методики могут быть легко адаптированы различных биологических систем и применяется в лабораторных условиях.