Hsp33 の酸化還元規制シャペロン活性を定義および水素重水素交換質量分析法による Hsp33 の構造変化をマッピング

細胞が活性酸素種 (ROS) 呼吸^1,2タンパク質と脂質の酸化の^3、4、および追加のプロセス^{5の副産物として生産の蓄積を頻繁に遭遇します。 6,7}。ROS の細胞シグナリング^8,9と免疫応答¹⁰など多様な生物学的プロセスに有益な役割にもかかわらず活性酸素産生とその解毒の間の不均衡が生じる、酸化につながる⁷を強調します。ROS の生物学的ターゲットには、タンパク質、脂質、核酸を酸化、構造と機能に影響を与えるが。したがって、細胞のオキシダントの蓄積が強く癌^9,11, 炎症^12,13, と高齢化^14,を含む病態の多様な範囲にリンクします。¹⁵発症し、アルツハイマー病、パーキンソン病のなどの神経変性疾患の進行と ALS 疾患^16,17,18に関与することがわかったとします。

新しく合成と成熟の両方のタンパク質は、タンパク質構造と機能^19,20を形作る彼らの側鎖の潜在的に有害な変更により酸化に敏感。したがって、酸化ストレスは、通常、広範なタンパク質不活性化、フォールディング、集約、最終的に細胞死につながるに します。クライアントが誤って折りたたまれたタンパク質^{21 と安定な錯体を形成する代わりに、広範な蛋白質の集合を抑制する酸化還元に依存したシャペロンを利用するタンパク質の酸化損傷の可能性に対処するエレガントな携帯電話戦略の 1 つです。 ,,2223}。これらの最初のライン防衛のシャペロンは、強力な抗凝集分子²⁴に変換する (通常のシステイン残基) サイト固有の酸化によって急速にアクティブ化されます。酸化ストレス条件^{25,26 中に正規の ATP 依存性シャペロンが少ない効果的な酸化ストレスは結果の呼吸阻害と細胞の ATP レベル25の減少で、以来、27}。そのため、ATP に依存しない付き添いのレドックス活性化再生細菌や真核生物におけるオキシダント濃度の蓄積に蛋白質の恒常性を維持する上で重要な役割 (例えば、Hsp33²⁸細菌、Get3 ライダー^{29 30}酵母、真核生物の進化: ペルオキシレドキシン³¹ )。これらのシャペロン活性は強くクライアント誤って折りたたまれたタンパク質の認識に関与する疎水性領域を明らかにするサイト固有の酸化による可逆的構造構造変化に依存します。

抗凝集機構とシャペロンによるクライアント タンパク質の認識を支配する原則の研究はシャペロン基板相互作用^{32,33のダイナミックなというヘテロな性質のため容易ではないです。 34,35,36,37}。ただし、シャペロンの応力規制能力による抗凝集機能の理解を進めるため機会がある: 1) シャペロン、(例えば、酸化) アクティブおよびアクティブでない (例えばの 2 つの異なるフォームを取得削減)、導入または簡単に (例えば、酸化剤と還元剤)、それらの 2 に切り替えのストレス条件の除去で) 3 基板の広い範囲を持っている) によって評価される可能性がありますクライアント蛋白質と非常に安定した複合体を形成異なる構造方法論、及び 4) 基質認識とリリースでは、これらのシャペロンの大半は、折りたたみ機能を欠いている、酸化還元に依存した構造変化を介したを取り上げます。

ここでは、我々 は細菌酸化還元規制シャペロン Hsp33 の抗凝集活性、酸化誘起タンパク質凝集²⁸に対して細菌の防衛システムの重要なコンポーネントを分析します。減少、Hsp33 はシャペロン アクティビティのないしっかりと折りたたまれた亜鉛結合タンパク質です。しかし、酸化ストレスにさらされたとき、Hsp33 は基板結合領域^38,39を公開する大規模な構造変化を経る。酸化に強く行きの C 末端ドメインの 4 つの非常に節約されたシステイン残基が亜鉛イオンはリリースされた⁴⁰です。これは、結果、隣接するリンカーの地域⁴¹の不安定化と C 末端ドメインの 2 つのジスルフィド結合の形成。C 末端とリンカーの地域は非常に柔軟な本質的にまたは部分的に障害として定義されています。非ストレス条件に戻り、減少、システイン、シャペロン抗凝集反応のない本来の折り畳まれた状態に戻ります。シャペロンのリフォールディングさらに展開につながり、バインドされたクライアント タンパク質リフォールディング³⁸正規シャペロン システム DnaK/J への転送をトリガーするの不安定化します。Hsp33 の相互作用部位の分析は、Hsp33 を使用して両方をキャプチャするリンカーと N 末端ドメインの疎水性領域と同様、地域にその請求乱れたミスフォールド蛋白質クライアント防ぎ、その集計^38,を示唆しています。⁴²。 折り返しリンカー、C 末端ドメインでたたんだ状態でこれらの地域は非表示。興味深いことに、リンカーの地域は、隣接する C 末端ドメイン³⁴の折りたたみの状態を「検出」Hsp33 の折り返しとアクティブでない状態のゲートキーパーとして機能します。(点突然変異または完全なシーケンスの摂動によってどちらか) の突然変異誘発によって不安定になり、一度 Hsp33 はその酸化還元に依存したシステイン⁴³の酸化還元状態に関係なく恒常活性シャペロンに変換されます。

ここに示すプロトコルは、Hsp33 の酸化還元に依存したシャペロン活性と同様のマッピング活性化に伴う構造変化の監視、クライアントのタンパク質の結合を許可します。この方法論は、他のシャペロン クライアント認識モデルだけでなく、非シャペロン タンパク質-タンパク質相互作用を研究する合わせることができます。また、タンパク質酸化蛋白質の活動の潜在的な役割を明らかにする他のスイッチ酸化還元タンパク質の研究で使用ことができます完全に還元と酸化のシャペロンの準備のためのプロトコルを提案する.

具体的には、我々 はシャペロン活性の in vitro監視し、タンパク質凝集 (化学的にまたは熱) による光散乱 (LS) を使用してさまざまな種類の下でその基質特異性を定義するプロシージャを記述する、fluorospectrometer⁴⁴。集計中に急速に増加の濁度による 360 nm の増加で散乱光。したがって、集計は、この波長での時間依存的に監視できます。LS は蛋白質の集合およびこうしてナノモル濃度では、異なるタンパク質凝集関連運動パラメーターの評価を有効にするを使用して興味の蛋白質の抗凝集活性テスト高速高感度法条件。さらに、ここで説明した LS プロトコルは高価な機器を必要としない、あらゆる研究室で簡単に設立することができます。

それにもかかわらず、「クリーン」の運動曲線を取得し、このような散乱ノイズと外れ値の空気の泡と大きな凝集体によって生成される数が多いため、実験から蛋白質の速度論的パラメーターを取得する非常に困難です。この障害を克服するために提案する新しいグラフィカル ツール、 Kfits⁴⁵、特に蛋白質凝集反応速度データの装備別の運動測定の騒音レベルを減らすために使用します。このソフトウェアは、結果の初期評価のため予備の速度論的パラメーターを提供し、「クリーンアップ」する大量データの迅速にその動力学的性質に影響を与えることがなくユーザーをことができます。Kfitsは Python で実装されている⁴⁵のオープン ソースで利用できます。

フィールドで挑戦的な質問の 1 つは、シャペロンとそのクライアントの蛋白質間相互作用部位のマッピングとシャペロンが誤って折りたたまれた基板の広い範囲を認識する方法を理解することに関係します。この問題はさらに複雑なシャペロンと集計しやすい基板上乱れた本質的に関連する非常にダイナミックな膜タンパク質を勉強します。幸いなことに、構造質量の最後の 10 年間で飛躍的に進んだし、有用なアプローチと構造の可塑性を分析してマップ残留タンパク質認識^46、に関連するツールを提供してきました^47,48,49紹介 1 つこのような技術水素重水素交換質量分析 (HDX-)-タンパク質修飾やタンパク質・ リガンド結合^{35、構造構造の残留レベル変更のマッピングが可能。 50,51,52,53,,5455}。HDX MS 重水素、割合とは、化学環境、アクセシビリティ、受けますがバックボーンの水素の連続的な交換を使用して、共有結合と共有結合⁵⁶。HDX MS は重水素化溶媒、一般的重水 (D₂O) を使用してこれらの exchange プロセスを追跡し、測定に基づく分子水素を重水素交換に次の変更が可能します。水素重水素交換の遅い速度は、水素の水素結合に参加することや、構造⁵⁷でローカルの変更を示す立体障害から単に、起因できます。リガンド結合や翻訳後修飾に伴う変化は、水素重水素交換 (HDX) 率^46,53の違いの結果バインドで水素環境の違いにつながることができます。

1) マップ Hsp33 の地域に急速に酸化、Hsp33 の活性化につながる時に展開し、2) そのフルレングスの誤って折りたたまれた基板、クエン酸合成酵素 (CS)³⁸Hsp33 の潜在的なバインディング インターフェイスを定義するこの技術を適用されます。

本稿で説明する方法は、蛋白質の生体外蛋白質機能の抗凝集活性と構造変化の役割 (存在する場合) を定義する酸化還元に依存する関数の研究に適用できます。これらの方法は、簡単に多様な生物学的システムに適応して研究室で適用できます。