הגדרת פעילות מוסדר חמצון-חיזור המלווה של Hsp33 ומיפוי השינויים הסתגלותי על Hsp33 באמצעות ספקטרומטר מסה של המרת מימן-דאוטריום

תאים פוגש לעתים קרובות הצטברות של מינים חמצן תגובתי (ROS) הפיק כמו תוצרי לוואי של נשימה^1,2, חלבון, שומנים בדם-חמצון-^3,–⁴תהליכים נוספים^{5, 6,7}. למרות תפקיד של ROS מועיל בתהליכים ביולוגיים מגוונים כגון הסלולר איתות^8,9 , התגובה החיסונית¹⁰, חוסר איזון בין ROS הייצור שלה ניקוי רעלים עשויה להתרחש, המוביל חמצוני להדגיש⁷. המטרות הביולוגי של ROS הם חלבונים, ליפידים, חומצות גרעין, החמצון של אשר משפיעים על מבנה ותפקוד שלהם. לכן, ההצטברות של הסלולר חמצון חזק מקושר במגוון רחב של פתולוגיות כולל סרטן^9,11,^12,דלקת¹³הזדקנות^{14, 15}, נמצאו מעורבים תחילת התפתחות הפרעות ניווניות כגון אלצהיימר, פרקינסון של ואת ALS מחלת^16,17,18.

חלבונים הן מסונתז לאחרונה, בוגרת רגישים מאוד חמצון לאור כל השינויים מזיקות של השרשראות בצד שלהם, המעצבים חלבון מבנה ותפקוד^19,20. לכן, סטרס חמצוני בדרך כלל מוביל חלבון נפוץ איון, misfolding, מצבור, המוביל בסופו של דבר למוות של התא. אחת האסטרטגיות הסלולר אלגנטית להתמודד עם הנזק הפוטנציאלי של חלבון חמצון זה לנצל את מלווים תלויי-חמצון-חיזור, אשר מעכבים את המצבור חלבון נרחבת, במקום יצירת קומפלקסים יציבים עם חלבונים misfolded לקוח^{21 22, ,23}. אלה מלווים שורה ראשונה הגנה מופעלים במהירות על ידי חמצון בייעודי לאתר (בדרך כלל על שאריות ציסטאין) הממיר אותן מולקולות אנטי-צבירת עוצמה²⁴. מאז סטרס חמצוני תוצאות עיכוב של נשימה, ירידה רמות ATP הסלולר²⁵, מלווים תלויית ATP הקנוני הם פחות יעילים בזמן סטרס חמצוני תנאים^{25,26 ,27}. לכן, חמצון-חיזור מופעל מלווים תלויית ATP ממלאים תפקיד חיוני בשמירה על הומאוסטזיס חלבון על ההצטברות של חמצון ב חיידקים וב פרוקריוטים (למשל, Hsp33²⁸ , רידא²⁹ ב חיידקים, Get3³⁰ , שמרים, peroxiredoxins³¹ פרוקריוטים). הפעילות של אלה מלווים בחום תלוי הפיך הסתגלותי שינויים מבניים הנגרמת על ידי חמצון בייעודי לאתר זה חושף מעורב ההכרה של חלבונים misfolded לקוח הידרופובי אזורים.

מחקר של מנגנון אנטי-צבירת ועקרונות המסדירים את ההכרה של החלבונים הלקוח על ידי מלווים אינה קלה בשל אופיו נדלנית ודינמיקה של המלווה-המצע אינטראקציות^{32,33, 34,35,36,37}. עם זאת, מלווים מוסדר מתח יש הזדמנות לקדם את ההבנה שלנו של פונקציית צבירה אנטי בשל היכולת שלהם: 1) לקבל שתי צורות שונות של המלווה, פעיל (למשל, מחומצן) לא פעיל (למשל, מופחת), עם הקדמה או הסרה של תנאי הלחץ בקלות להחליף ביניהם (למשל, חמצון, צמצום הסוכן), 2), יש מגוון רחב של מצעים, 3) קומפלקסים יציבים מאוד עם החלבונים לקוח זה יכול להיות מוערך על ידי מתודולוגיות מבניים שונים, ו- 4) להתמקד אך ורק על המצע זיהוי ושחרור, מתווכת על-ידי שינויים הסתגלותי תלויי-חמצון-חיזור, כמו הרוב המכריע של אלה מלווים חסר יכולת קיפול.

כאן, אנחנו מנתחים פעילות אנטי-צבירת חיידקי מוסדר חמצון-חיזור המלווה של Hsp33, מרכיב חיוני של מערכת הביטחון חיידקי נגד חמצון-induced חלבון צבירת²⁸. כאשר מופחתת, Hsp33 הוא חלבון מחייב אבץ בחוזקה מקופל עם שום פעילות המלווה; עם זאת, כאשר הם נחשפים סטרס חמצוני, Hsp33 עובר שינויים נרחבים הסתגלותי החושפות את המצע איגוד אזורים^38,39. על חמצון, יון אבץ המאוגד חריפה ארבע ציסטאין שנשמרת מאוד שאריות של התחום C-מסוף הוא שוחרר⁴⁰. התוצאה על היווצרות שני דיסולפידי חוב, התגלגלות של התחום C-מסוף, לבין הקשורה של אזור מקשר סמוכים⁴¹. האזורים C-מסוף, מקשר גמיש במיוחד, מוגדרים כמו מהותית או חלקית סמוקים. עם שובו לתנאים שאינם מתח, cysteines מצטמצמות ומחזירה המלווה למצבו מקופל מקורית עם שום פעילות אנטי-צבירה. Refolding של המלווה מוביל ייפתחו עוד יותר, destabilization של החלבון לקוח מאוגד, אשר מפעיל את ההעברה למערכת המלווה הקנוני, DnaK/J, עבור refolding³⁸. ניתוח האתרים האינטראקציה של Hsp33 מרמז כי Hsp33 משתמשת בשני שלה טעונה סמוקים אזורים, כמו גם את האזורים הידרופובי מקשר, תחום N-מסוף כדי ללכוד misfolded חלבונים הלקוח ולמנוע צבירת שלהם^{38, 42}. במצב מקופל, אזורים אלה מוסתרים על ידי מקופלת מקשר C-מסוף תחום. מעניין, האזור מקשר משמש שוער של מצב מקופל ובלתי פעילה של Hsp33, “חש” מעמד מתקפל שלה מחשבים סמוכים C-מסוף³⁴. ברגע גרם אולי לפגיעה ביציבות על ידי מוטגנזה מכוונת (גם על ידי מוטציה או של ההפרעות רצף מלא), Hsp33 מומר מלווה צורונים פעילים בכל מקרה מצב חמצון-חיזור שלה רגיש חמצון-חיזור cysteines⁴³.

הפרוטוקולים המובאת כאן מאפשרים ניטור של Hsp33 פעילות המלווה תלוי-חמצון-חיזור, כמו גם שינויים הסתגלותי מיפוי על הפעלת ואיגוד של הלקוח חלבונים. מתודולוגיה זו ניתן להתאים מחקר מלווה-לקוח זיהוי דגמים אחרים, כמו גם אינטראקציות חלבון שאינו מלווה. יתר על כן, אנו מציגים פרוטוקולים עבור הכנת מלווים מלא מופחת, מחמצנים יכולים לשמש במחקרים אחרים חלבונים חמצון-חיזור-switch, כדי לחשוף את תפקידי פוטנציאלי של חלבון חמצון על פעילות החלבון.

באופן ספציפי, אנו מתארים הליך לפקח המלווה הפעילות במבחנה ולהגדיר שלה ירידה לפרטים המצע תחת סוגים שונים של צבירת חלבון (כימי או תרמית המושרה) באמצעות פיזור אור (LS) נמדדת fluorospectrometer⁴⁴. במהלך מצבור, אור פיזור ב 360 nm מגדיל במהירות עקב עכירות הגוברת. לפיכך, צבירת ניתן לנטר באופן תלוי-זמן ובאורך הגל הזה. ? האם היא שיטה מהירה ורגיש לבדיקת חלבון צבירת ובכך הפעילות האנטי-צבירה של חלבון עניין באמצעות ריכוז nanomolar, המאפשרת אפיון חלבון צבירת קינטי פרמטרים הקשורים תחת שונות תנאים. יתר על כן, הפרוטוקול LS המתוארים כאן אינו דורש מכשור יקר, ניתן ליצור בקלות במעבדה כלשהי.

עם זאת, די מאתגר כדי להשיג. את עקומות קינטי “נקי” וכדי שואבים פרמטרים קינטי של חלבון אור כזה פיזור ניסויים, בשל רעש ואת המספר הגדול של ליניאריים שנוצרו על-ידי בועות אוויר, אגרגטים גדולים. כדי להתגבר על מכשול זה, אנו מציגים את הרומן כלי גרפי, Kfits⁴⁵, להשתמש להפחתת רמת הרעש במדידות קינטית שונה, מותאם במיוחד עבור חלבון צבירת נתונים קינטי. תוכנה זו מספקת ראשונית פרמטרים קינטי הערכה מוקדמת של התוצאות ומאפשרת למשתמש “נקי” כמויות גדולות של נתונים במהירות מבלי להשפיע על תכונותיו קינטי. Kfits הוא מיושם פייתון וזמין קוד פתוח בגיל ⁴⁵.

אחת השאלות מאתגרת בתחום מתייחס מיפוי אתרי האינטראקציה בין מלווים וחלבונים לקוח שלהם ולהבין איך מלווים לזהות מגוון רחב של סובסטרטים misfolded. שאלה זו היא יותר מסובך כאשר לומד קומפלקסים דינמי מאוד חלבון אשר כרוכים ממהותם סמוקים מלווים ותערובות צבירת מועדת. למרבה המזל, ספקטרומטר מסה מבניים התקדמה באופן דרמטי במהלך העשור האחרון, סיפק בהצלחה מועיל גישות וכלים כדי לנתח את פלסטיות מבניים מפת משקעים מעורב חלבון זיהוי^{46, 47 , 48 , 49}. כאן, אנו מציגים אחד כזה טכניקה-מימן-דאוטריום exchange ספקטרומטר מסה (HDX-MS)-מה שמאפשר את המיפוי של שינויים ברמת שאריות קונפורמציה מבנית שינוי חלבון או חלבון/ליגנד מחייב^{35, 50,51,52,53,54,55}. HDX-MS משתמשת ההחלפה רציף של עמוד השדרה hydrogens על ידי דאוטריום, הקצב של אשר מושפעת הסביבה כימי, נגישות, ואת קוולנטיות על קשרים הדדיים⁵⁶. HDX-MS עוקב אחר תהליכים אלה exchange באמצעות בתור ממיס deuterated, בדרך כלל מים כבדים (D₂O), ומאפשר מדידה המבוססת על שינוי משקל מולקולרי בעקבות המימן דאוטריום exchange. איטי שערי החליפין מימן-דאוטריום עלולה לגרום hydrogens השתתפות קשרי מימן, או, בפשטות, מעצורים הסטריים, אשר מציינת שינויים המקומיות מבנה⁵⁷. שינויים על איגוד ליגנד או שינויים post-translational יכול גם להוביל הבדלים הסביבה מימן, עם איגוד וכתוצאה מכך הבדלים מימן-דאוטריום exchange (HDX) המחירים^46,53.

אנחנו להחיל טכנולוגיה זו לאזורים 1) מפה Hsp33 אשר במהירות נפרשים על חמצון, שמוביל ההפעלה של Hsp33, ו- 2) הגדרת ממשק איגוד פוטנציאלי של Hsp33 עם סובסטרט misfolded באורך מלא שלו, ציטרט סינתאז (CS)³⁸.

ניתן להחיל בשיטות המתוארות בכתב יד זה ללמוד בחריגי חמצון-חיזור של חלבונים במבחנה, צבירת נגד פעילות ואת התפקיד של שינויים מבניים (אם בכלל) בתפקוד החלבון. מתודולוגיות אלה יכול להיות בקלות להתאים מגוון מערכות ביולוגיות ומוחלים במעבדה.