人隐静脉的去细胞和 Recellularization 方法学研究

使用的组织, 本文的协议遵循了哥德堡大学的伦理准则。 1. 组织准备和贮存 用手术钳和剪刀切开所提取的隐静脉的周围组织。注: 隐静脉由血管外科医生从人类下肢解剖。本论文所用的隐静脉是旁路术后未使用的部分。 为防止在灌注过程中出现渗漏, 结扎所有侧支在其末端用缝线和镊子。 将静脉放在含有40毫升磷酸盐缓冲盐水 (PBS) 的50毫升管中。通过改变 PBS 2-3 倍来清洗静脉, 以清除多余的血液。将静脉冷冻保存在摄氏-80 摄氏度。 2. 去细胞设置和 Recellularization 生物反应器的制备 注: 使用剪刀, 切割硅管如表 1所示。 去细胞设置 1 (用于海卫 X-100 灌注和洗涤) 到2升室 (塑料浴缸), 胶带所有三件管 a, 如图 1A所示。注: 胶带一管到一壁, 边缘触及腔底 (洗涤剂的入口) 和其他两个管到对面墙上的距离为 5-10 厘米之间的长度取决于静脉。至少5厘米的这些管子也应贴在房间的地板 (静脉的入口和出口)。 使用男女鲁尔连接器, 串联洗涤剂的入口管到管 B, 然后管 F, 管 C, 最后到静脉入口。把管子 F 放进蠕动泵的卡带里。 再拿一根管子, 把一端连接到静脉的出口。将另一端放入玻璃罐中, 底部软管插座放置45厘米以上的房间 (洗涤剂出口) 和磁带, 以确保安全。取管 G 并将一端推入玻璃罐的软管出口, 然后将另一端置于静脉腔内。注: 完整设置 (红色箭头)、腔室和流方向 (白色箭头) 的图片如图 1A所示。 去细胞设置 2 (用于 TnBP 灌注) 拿一个1升的玻璃罐子, 把管子 C (洗涤剂入口) 的一端放到罐子里, 直到管子碰到罐子的底部。 将另一端与管 F 连接, 然后管 c 将管 c 的另一端放入罐中, 直到半深度 (静脉入口)。将管 F 放入蠕动泵盒中。 取管 D, 将一端放入罐子 (静脉的出口), 直到半深度, 另一端进入玻璃罐, 底部软管放置在45厘米高的静脉入口 (洗涤剂出口)。为了确保, 胶带的洗涤剂的入口和出口管。 将1升玻璃罐放在磁力搅拌器上, 将磁铁放在瓶子内。 取管 G, 将一端推到玻璃瓶的软管出口上, 将另一端置于1升玻璃罐中。注:图 1B显示了完整设置 (红色箭头)、腔室和流方向 (白色箭头) 的图片。 去细胞设置 3 (用于 DNase 灌注) 取一个250毫升的玻璃瓶, 将管的两端放置在软管的中间区域进入蠕动泵的卡带中。注: 管的一端是溶液入口, 管的另一端连接到静脉的入口。静脉的出口在溶液中是无保留的。 将整个安装, 包括泵在摄氏37摄氏度。图 1C显示了完整的设置和流方向的图片。 Recellularization 生物反应器 准备好所有的零件, 如图 2A所示。 如图 2B所示, 取4端口盖并插入到每个端口, 管 H (静脉的出口), 管 I (介质入口) 和管 J (静脉的入口)。将管 H 的另一端插入4端口 (介质插座)。注意: 从顶部的4端口盖的视图显示在图 2C中。为了便于插入管子, 用剪刀将边缘剪成尖点。 将管 J 的另一端弯曲成 U 形, 并将其与缝合线栓在一起。将还原连接器连接到管子的内端 & J。 将60毫升管与一个扁平底座放入250毫升玻璃瓶中, 然后将上述设置安装到管中, 如图 2D所示。如图 2E所示, 连接管 k、E 和 k 串联。连接一个管 k 到静脉的入口和另一个管 k 到介质入口。注意: 安装的示意图和流量方向见图 2F。 用热处理消毒生物反应器。 3. 解决方案的准备工作 解决方案 1 (10x 水): 对1升的超纯水, 添加2克叠氮化钠和18.6 克乙二胺乙酸 (EDTA)。搅拌直到盐溶解。 解决方案 2 (1x 水): 采取100毫升的溶液1和添加900毫升的超纯水。 解决方案 3 (5x 海卫 X-100): 950 毫升的超纯水, 添加50毫升的海卫 X-100, 1 克叠氮化钠和9.3 克 EDTA。搅拌直至溶解。 解决方案 4 (1x 海卫 X-100): 采取200毫升的溶液3和添加800毫升的超纯水。 解决方案 5 (1x TnBP): 添加10毫升的 TnBP 与10毫升吸管到990毫升的解决方案2。 解决方案 6 (40 Kunitz 单位/毫升 DNase): 添加 2000 Kunitz 单位 DNaseI 50 毫升 Dulbecco 的磷酸盐缓冲盐水含有 CaCl2和氯化镁2。准备新鲜, 立即使用。 解决方案 7 (PBS): 加入24克氯化钠, 0.6 克氯化钾, 4.32 克磷酸磷酸钠, 0.72 克磷酸钾为3升的超纯水。搅拌直至溶解。将 pH 值调整为7.4。在高压釜内消毒1升 PBS, 并分别贮存。 溶液 8 (0.1% 过氧乙酸): 对50毫升的无菌溶液 7, 添加50µL 的过氧乙酸。准备新鲜, 立即使用。 4. 内皮介质的制备 添加5毫升的 l-谷氨酰胺, 5 毫升抗反, 50 毫升的人 AB 血清和所有成分的 EGM-2 生长因子套件, 除胎牛血清到500毫升的 MCDB131 培养基下的无菌罩。 5. 隐静脉去细胞 在室温下将人隐静脉从-80 摄氏度解冻。再次冻结在-80 摄氏度和解冻再次在室温下。 用剪刀切开2毫米长的活检, 在室温下固定甲醛 24-48 小时。将静脉的每一端与一条缝合的雄性和雌性鲁尔连接器的倒钩系在一起。 将静脉连接至去细胞设置 1, 填充溶液2的1升。灌注为15分钟, 在35毫升/分钟. 清空安装程序的内容。 添加 1 L 的溶液4和灌注为4小时在35毫升/分钟. 清空安装程序的内容。 添加500毫升溶液2和灌注5分钟. 清空安装程序的内容。重复此步骤。从灌注设置1断开静脉, 并连接到灌注设置2。 添加 1 L 的解决方案 5, 打开搅拌器和灌注4小时在35毫升/分钟。注意: 在打开搅拌器和整个灌注过程中, 解决方案5看起来多云。 断开静脉从灌注设置2和洗涤静脉的外部和内部与注射器或10毫升吸管在4变化的超纯水 5-10 分钟。 将静脉连接至灌注设置 3, 在37°c 室中添加50毫升溶液6和灌注, 4 摄氏度. 清空安装程序的内容, 并断开静脉与安装程序的连接。 将静脉连接至灌注设置 1, 将溶液2和灌注的1升填入35毫升/分钟. 重复步骤5.4 至步骤 5.9 4 次 (总共5个循环)。如步骤5.2 所述, 再次进行活检。注: 跳过步骤5.8 第二部分在周期1和3。 清空安装程序的内容。1 L 的解决方案2和灌注为24小时在35毫升/分钟. 更改解决方案2后 12 h. 清空安装程序的内容。在35毫升/分钟内, 1L 的超纯水和灌注24小时. 在12小时后改变超纯水. 清空安装程序的内容。1 L 的解决方案7和灌注24小时在35毫升/分钟. 更改解决方案7后 12 h。 6. 去细胞的核查 用超纯水清洗福尔马林固定活检15分钟, 在组织处理器中进行标准协议, 并嵌入石蜡22。 5µm 部分使用切片和染色与迈耶的苏木精和0.2% 酒精的伊红 (H & E) 遵循标准协议22。 在显微镜下查看与正常组织相比, 瓣膜组织中核的损失。 7. Recellularization 将静脉放在含有50毫升溶液8的50毫升管中杀菌。搅拌在80旋转每分钟 (rpm) 在振动筛为1小时37摄氏度。 从现在起, 处理层流 (黎巴嫩) 内阁下的静脉以维持不孕。用无菌钳将静脉转移到新的50毫升管中, 含有50毫升的无菌溶液7和500µL 抗反。为12小时以上的搅动, 改变解决方案7至少两次之间。 使用无菌钳, 将静脉转移到新的50毫升管, 并添加50毫升的内皮介质。11小时以上的鼓动。 使用无菌手套在黎巴嫩武装部队内阁中组装生物反应器。用无菌缝合和镊子将静脉栓在生物反应器的静脉入口和出口处。 将静脉连接到生物反应器, 并用相同的培养基填充。添加肝素在50毫升/毫升和灌注1小时在 2 mL/分钟37摄氏度。 收集 15-25 毫升的新鲜血液 (取决于静脉的长度) 从捐赠者在肝素涂层 vacutainer 管和稀释1:1 与斯蒂恩溶液。随后, 添加内分泌腺体衍生血管内皮生长因子 (如 VEGF, 80 ng/毫升), 碱性成纤维细胞生长因子 (b 蛋白, 4 µL/毫升) 和乙酰水杨酸 (5 µg/毫升)。 将生物反应器移动到一个37°c 孵化器与 5% CO2和灌注为 48 h 在2毫升/分钟。 大约在12小时之后, 将生物反应器移动到一个黎巴嫩武装部队的柜子里, 用血糖监测装置取一滴血, 用葡萄糖来测量血糖。如果水平小于3毫摩尔, 添加葡萄糖, 使 7-9 毫摩尔/l 的范围重复此步骤每 8-12 h。 48小时后, 将生物反应器移到黎巴嫩武装部队的柜子中, 将血液从生物反应器中排出。添加30毫升的无菌溶液7和灌注5分钟排出溶液。添加30毫升的无菌溶液7和灌注5分钟. 重复两次或直到血红色消失。注: 活检可用于验证细胞附件。拔下静脉, 用剪刀将静脉切开5毫米边缘, 然后丢弃。采取步骤5.2 所述的活检, 再次将静脉连接到生物反应器 (可选步骤)。 增加30-45 毫升内皮培养基和灌注96小时的孵化器在2毫升/分钟。注: 添加内皮介质, 直到静脉被淹没。 将生物反应器移动到黎巴嫩武装部队的内阁, 断开 recellularized 静脉, 用剪刀剪断静脉的5毫米边缘, 然后丢弃。按照步骤5.2 中的说明进行活检。 8. Recellularization 的核查 按照6节中的说明操作, 执行 H & E 染色。检查显微镜下的幻灯片是否存在细胞。