蛋白質の相互作用を比較するバッチの酵母 2 ハイブリッド スクリーン

細胞生物学的プロセスの完全な理解は、その分子機構の根底にある蛋白質相互作用ネットワークの検索に依存します。蛋白質の相互作用を識別する 1 つの方法は興味の蛋白質の 2 つの領域は互いにバインド¹一度機能しているキメラ転写因子を組み立てることによって動作する酵母 2 ハイブリッド (Y2H) 試金。Y2H の典型的なスクリーンがプラスミド転写活性化因子に融合相互作用の蛋白質の両方図書館を収容する酵母の人口を作成することによって実行されます (例えば.、’捕食’ 融合タンパク質) とタンパク質から成る特定の ‘餌’ プラスミド興味の DNA 結合ドメイン (例えば、Gal4 上流活性化シーケンスにバインド Gal4 DNA 結合ドメイン) に溶けます。Y2H アプローチの主な利点の 1 つは、比較的簡単だし、ルーチンワーク分子生物²の典型的な研究室で実施する安価な装備です。しかし、伝統的に実行されると、ユーザーは正の Y2H 相互作用の選択により発生する個々 のコロニーをサンプリングします。これは、調査することができますライブラリ ‘捕食’ クローンの数を厳しく制限されます。この問題は、特定の相互作用する獲物の豊富さが非常に高い他、低豊富な獲物プラスミドからの相互作用を検出する機会を減少と関連した合成されます。

プロテオームの包括的なカバレッジの Y2H 原理を使用して 1 つのソリューションは、知られている個々 の獲物プラスミドを含む配列を前記デジタルに尋問できるマトリックス形式のアプローチの使用です。ただし、このようなアプローチは蛋白質またはドメイン³の少数のインタラクトームを定義する際に興味を持っている個々 の捜査官に容易にアクセスや費用対効果のないインフラストラクチャが必要です。さらに、複数のフラグメントの相互作用の蛋白質を符号化するかもしれない非常に複雑な獲物ライブラリは、非現実的なサイズにこのような行列の配列のサイズを拡大します。代わりに、バッチで複雑なライブラリとアッセイを行い、大規模な並列高スループット シーケンス⁴を使用して相互作用するクローンの存在を評価します。これはアッセイの典型的なを使用して複数のコロニーで発生する獲物プラスミドの存在に適用できる Y2H 形式アプローチする酵母の細胞融合蛋白質の相互作用のペアを住宅プレート^5,6に成長すること。この一般的な考えは、両方の複数の餌のクエリを増やすし、同じ時間^7,8のコンポーネントを獲物に強調することができます。

それでも、多くの調査は簡単にまだ努力に注力ほんのタンパク質 ‘餌’ を必要とし、単一の複雑な獲物ライブラリの包括的な半定量的なクエリによって恩恵を受けることができます。我々 は開発し、バッチ形式⁴で Y2H 原理を用いた大規模タンパク質相互作用研究を実行するアプローチを検証します。Y2H 相互作用⁹の相対的な強さのためのプロキシとして特定の獲物プラスミドの膨張率を使用します。集団内のすべてのプラスミドのディープ シーケンスが正常な成長を受けるまたは選択成長条件は、強くて弱い Y2H 相互作用を得られるクローンの完全なマップを生成します。インターアクターのレパートリーを入手し、直接複数の餌プラスミド間で比較することができます。Deepn 深さ (評価のタンパク質ネットワークの動的な濃縮) と呼ばれる作成されたワークフローは、対別のもの 1 つのタンパク質の比較を許可する蛋白質を識別する同じ獲物ライブラリから差分 interactomes を識別するためにこのように使用できます。

Deepn 深さを示すここでは、図 1に記載されている、その使用を容易にする実験室方法の改善を紹介。大幅な改善が含まれます。

獲物酵母集団の生成します。プラスミド獲物ライブラリの分布が同じ別の餌プラスミドと酵母の集団の生成 deepn 深さの重要な要件の 1 つです。獲物プラスミド ライブラリの同等基準集団が異なる餌の interactomes 間の正確な比較を行うために不可欠です。これは最高のライブラリ プラスミドは既に建物半数体酵母の人口で、その人口に与えられた餌のプラスミドの移動は、二倍体を生成する交配によって達成されるとき達成します。ここでは、我々 は半数体酵母の市販のライブラリを使用してこのような集団を作る方法で、明確な指針を提供します。我々 は二倍体数が多いを生成するメソッドを発見したが、これら商用ライブラリを含む酵母菌の全体的な交尾効率が低かった。したがって、交配反応あたりはるかに多くの切片が得られます獲物ライブラリを収容できる新しいひずみを構築しました。

新しい餌プラスミドの設定をします。エクスプレス ‘餌’ 融合蛋白質で構成される興味の DNA 結合ドメインとタンパク質の多くの現在のプラスミドは、2 μ ベース、コピー数を増幅させることです。このコピーの数は、人口の非常に変数をでき、Y2H 転写応答の可変性に 。これは、ターンでは選択範囲の下のセルの成長の応答に基づいて特定の蛋白質の相互作用の強さを測定する能力が偏る可能性があります。これは、部分的アドレスのいくつかは以前市販 pDEST32¹⁰など記載されている低コピー プラスミドを用いた。上流の餌フラグメントの両方のクローンを作成ことができます Kanr 耐性遺伝子を運ぶTRP1セントロメア ベース低コピー プラスミド内 Gal4 DNA 結合ドメイン融合蛋白質を作り出す新しい餌プラスミド (pTEF GBD) を構築したとGal4 DNA 結合ドメインの下流。

新しい高密度 Y2H フラグメント ライブラリ。家 Y2H 獲物ライブラリに新しいプラスミドを構築し、ゲノム DNA の断片をランダムにせん断の酵母から作られた非常に複雑な Y2H ライブラリをビルドするために使用します。シーケンス解析は、このライブラリが前述の酵母ゲノム Y2H プラスミド ライブラリ¹¹よりも遠く複雑以上 100 万の異なる要素を持っていたことを示した。この新しいライブラリ DEEPN ワークフローが堅牢な信頼性が高く、再現性のある方法で多くの異なるプラスミドを持つ複雑なライブラリに対応することを示すことができました。