Een gist 2-Hybrid scherm in Batch om te vergelijken eiwitinteractie

Een volledig inzicht in biologische processen van de cel is afhankelijk van het vinden van de Eiwit-interactienetwerken die ten grondslag liggen aan hun moleculaire mechanismen. Een benadering te identificeren eiwitinteractie is de gist 2-hybrid assay (Y2H), die werkt door het monteren van een goed functionerende chimeer transcriptiefactor zodra twee domeinen van de proteïne van belang aan elkaar^{1 binden}. Een typische Y2H scherm wordt uitgevoerd door het creëren van een bevolking van gist dat huizen van beide een bibliotheek van plasmiden, interacterende eiwitten, gesmolten tot een transcriptionele activator codering (bv., ‘prooi’ fusieproteïne) en een bepaalde ‘lokaas’ plasmide bestaat uit het eiwit gesmolten tot een DNA-bindende-domein (bijvoorbeeld, de Gal4 DNA-bindend domein dat zich aan de Gal4-upstream activerend volgorde bindt) van belang. Een van de belangrijkste voordelen van de Y2H-aanpak is dat het is relatief eenvoudig en goedkoop uit te voeren in een typische laboratorium voor moleculaire biologische routinewerk^{2 uitgerust}. Echter als traditioneel uitgevoerd, monsters een gebruiker afzonderlijke kolonies die zich bij de selectie voor een positieve interactie met de Y2H voordoen. Dit beperkt ernstig het aantal bibliotheek ‘prooi’ klonen die kunnen worden onderzocht. Dit probleem wordt nog verergerd wanneer de overvloed aan een bepaalde interactie prooi zeer hoog ten opzichte van de anderen is, het afnemen van de kans op interactie van lage overvloed prooi plasmiden opsporen.

Een oplossing voor het gebruik van het Y2H-beginsel in de uitgebreide dekking van de Proteoom is het gebruik van een matrix-indeling aanpak waarin een array met daarin bekende individuele prooi plasmiden digitaal kan worden ondervraagd. Een dergelijke benadering vereist echter een infrastructuur die niet gemakkelijk toegankelijk te laten of kosteneffectieve aan individuele onderzoekers die geïnteresseerd zijn in het definiëren van de interactome van een klein aantal proteïnen of domeinen³. Bovendien zou zeer complexe prooi bibliotheken die meerdere fragmenten van interacterende eiwitten kunnen coderen de grootte van deze matrix arrays uitbreiden naar onpraktisch maten. Een alternatief is het uitvoeren van testen met complexe bibliotheken in batches en beoordelen van de aanwezigheid van interagerende klonen met massale parallelle high-throughput sequencing⁴. Dit kan worden toegepast om de test op de aanwezigheid van plasmiden met prooi, die zich voordoen in meerdere kolonies met behulp van een typische Y2H opgemaakt aanpak in welke gist cellen huisvesting een interactie paar fusion eiwitten zijn toegestaan om te groeien op een plaat^5,6. Dit algemene idee kan worden geaccentueerd ter vergroting van de query van beide meerdere aas en prooi onderdelen op de dezelfde tijd^7,8.

Toch veel onderzoeken vereisen dat een gemakkelijker nog meer gericht inspanning op slechts een paar eiwit ‘lokaas’ en meer kunnen profiteren door een uitputtende en semi-kwantitatieve-query van een enkele complexe prooi-bibliotheek. Wij hebben ontwikkeld en gevalideerd van een aanpak voor het uitvoeren van grootschalige eiwit interactie studies gebruik te maken van een Y2H principe in batch formaat⁴. Deze maakt gebruik van het tempo van de expansie van een specifieke prooi plasmide als een proxy voor de relatieve sterkte van Y2H interactie⁹. Diepe sequentiebepaling van alle plasmiden binnen een populatie onderworpen aan normale groei of selectieve groei omstandigheden produceert een volledige kaart van klonen dat de opbrengst van de sterke en zwakke Y2H interacties. Het repertoire van interactors kan worden verkregen en rechtstreeks met elkaar vergeleken in meerdere aas plasmiden. De resulterende workflow genoemd DEEPN (dynamische verrijking voor evaluatie van de netwerken van de eiwitten) kan dus worden gebruikt om te identificeren van differentiële interactomes uit de dezelfde prooi bibliotheken te identificeren van eiwitten, waardoor vergelijking tussen één eiwit vs. andere.

Hier tonen we DEEPN en verbeteringen in de laboratoriumtechnieken die vergemakkelijken het gebruik ervan, die worden beschreven in Figuur 1. Belangrijke verbeteringen zijn onder andere:

Generatie van prooi gist bevolking. Een van de belangrijkste vereisten van DEEPN is het genereren van populaties van gist met verschillende aas plasmiden die de dezelfde verdeling van de plasmide prooi bibliotheken hebben. Gelijkwaardige basislijn populaties van de prooi plasmide bibliotheek zijn essentieel voor hetgeen een exacte vergelijking tussen de interactomes van verschillende lokaas. Dit gebeurt best bij een plasmide bibliotheek al is gehuisvest in een haploïde gist bevolking en een bepaalde aas plasmide betreden die bevolking wordt bereikt door de paring voor de productie van een diploïde. Wij bieden hier een duidelijke handleiding in hoe te maken van dergelijke populaties commerciële bibliotheken gehuisvest in haploïde gist gebruiken. Hoewel we vonden de methoden die het genereren van een groot aantal ze, was de paring totaalrendement van deze commerciële bibliotheek-bevattende giststammen laag. Dus we hebben gebouwd een nieuwe spanning die kan huis prooi bibliotheken die veel meer ze per paring reactie oplevert.

New set van aas plasmiden. Veel huidige plasmiden die uitdrukking geven aan ‘lokaas’ fusion eiwitten bestaat van de proteïne van belang en een DNA-bindende domein zijn 2µ gebaseerde, waardoor ze hun exemplaaraantal versterken. Deze exemplaaraantal kan heel variabel in de bevolking en leiden tot variabiliteit in het Y2H transcriptionele antwoord. Dit kan op zijn beurt de mogelijkheid om te meten de sterkte van een bepaald eiwit interactie op basis van de reactie van de groei van cellen onder selectie scheeftrekken. Dit kan gedeeltelijk adres met behulp van een laag kopie plasmide, waarvan sommige eerder zoals de verkrijgbare pDEST32^{10 beschreven zijn}. We hebben een nieuwe aas plasmide (pTEF-GBD) die produceert Gal4-DNA-bindende domein fusion eiwitten binnen een TRP1 laag kopie centromeer gebaseerde plasmide uitvoering van het Kanr-resistentie gen waarmee ook klonen van aas fragmenten, zowel stroomopwaarts gebouwd en stroomafwaarts van het domein van Gal4 DNA-bindende.

Nieuwe High-Density Y2H fragment library. We gebouwd een nieuwe plasmide naar huis Y2H prooi bibliotheken en gebruikt het om te bouwen van een uiterst complexe Y2H bibliotheek gemaakt van willekeurig sheared fragmenten van genomic DNA van Saccharomyces cerevisiae. Sequentieanalyse toonde aan dat deze bibliotheek had meer dan 1 miljoen verschillende elementen, veel complexer dan hierboven beschreven gist genomische Y2H plasmide bibliotheken¹¹. Met deze nieuwe bibliotheek waren we kunnen laten zien dat het DEEPN werkstroom robuust genoeg is voor complexe bibliotheken met vele verschillende plasmiden op een wijze die betrouwbaar en reproduceerbaar is.