慢性リンパ性白血病の免疫グロブリン遺伝子のシーケンス解析: シーケンスの解釈に患者材料から
1Institute of Applied Biosciences,Centre for Research and Technology Hellas, 2Department of Immunology, Genetics and Pathology, Science for Life Laboratory,Uppsala University, 3Department of Molecular Medicine and Surgery,Karolinska Institutet, 4Division of Immunology, Transplantation and Infectious,IRCCS San Raffaele Scientific Institute, 5Department of Immunology, Laboratory for Medical Immunology,Erasmus University Medical Center, 6Hematology Department,Nikea General Hospital, 7Assistance publique – Hôpitaux de Paris (AP-HP), Hopital Pitié-Salpêtrière, Department of Hematology, and UPMC University Paris 06, UMRS 1138, 8Division of Experimental Oncology,IRCCS Istituto Scientifico San Raffaele and Università Vita-Salute San Raffaele
Summary
本明細書での欧州研究イニシアチブの蓄積された経験に基づいて技術的な側面の詳細および慢性リンパ性白血病 (CLL) 患者の堅牢な IG 遺伝子のシーケンス解析を確保するための必須要件をプロトコルを提案します。CLL (エリック)。
Abstract
B 細胞の成熟に伴う免疫グロブリン (IG) 遺伝子 V (D) J の組み変えの複雑なプロセスは個々 の B セル内でユニークな DNA シーケンスに上昇する体性 hypermutation (SHM) とつながれます。IG 遺伝子が個々 の患者にすべての悪性細胞に一般的なユニークな分子シグネチャを表す単一細胞のクローン性増殖から B 細胞悪性腫瘍が原因で、したがって、免疫グロブリン遺伝子の再構成は、クローンのマーカーとして使用できます。重要なクローン識別子として機能に加えて、IG 遺伝子の塩基配列は、以来、特定の発達段階に関連付けられ、B 細胞腫瘍の変換に関与するの歴史を反映するそれ故に ‘分子タイムとして機能できます。また、特定の悪性腫瘍、特に慢性リンパ性白血病 (CLL) IG 遺伝子の塩基配列を保持予後および潜在的予測機能します。つまり、免疫グロブリン遺伝子のシーケンス解析から意味のある結論を外挿することは不可能だろう強力なメソッドやツール、分析のために使用されなかった場合。この記事は、CLL (エリック)、技術的な側面の詳細と CLL、今お勧めするテストの信頼性が高く、再現性のある IG 遺伝子配列解析をするために必要不可欠な要件に関する欧州研究イニシアティブの広大な経験上に描画治療前にすべての CLL の患者。具体的には、さまざまな分析段階、clonotypic IG 遺伝子転位の同定と塩基配列の決定から IG 遺伝子シーケンス データの正確な臨床的解釈に至るまでを説明します。
Introduction
慢性リンパ性白血病 (CLL)、西部国で成人の白血病の最も一般的な形式は、1成熟腫瘍性 B 細胞のクローン性増殖によって特徴付けられます。病気のコースは臨床的観点から、積極的な病が発生して、診断後非常に早期の治療を必要として多くの場合再発されたり療法に不応性患者の一部と非常に変数です。これは無痛症を提示、治療を必要とする、年齢をマッチさせた健常者2のような平均余命 (~ 30%) の患者のかなりの割合は対照的です。この臨床の多様性は、最終的に病因と病3の進行駆動 CLL 患者が見つかりました分子異常の多様性に反映されます。
CLL の診断は通常簡単に確立すること、ただし、前述臨床不均質性 CLL 患者の効果的な管理を妨げる可能性がありで助けることができると予後予測マーカーの必要性を強調治療意思決定2。数多くの研究提案4をされている新しい臨床的および生物学的マーカーの豊富さで最高潮に達する、CLL の前兆を調整しようとしています。Clonotypic 免疫グロブリン重変数 (IGHV) 遺伝子の突然変異の状態は CLL、最も堅牢な予後マーカーの 1 つ主原因という事実に (i) それは安定したまま時間が経つと疾患の進行により、(ii)、他の独立しました。臨床的および生物学的パラメーター5。にもかかわらず、IGHV 突然変異の状態を含む場合、非常に少数のマーカーは、診断の時点で臨床に現在適用されています。
1999 年、2 つの独立した研究報告なしの患者がまたは最小限の体性 hypermutation (SHM) 負荷 (一 CLL、U CLL) まで遡って CLL 日 IG 遺伝子配列の臨床的有用性の最初の報告があるを運んでいる患者よりも予後が悪い、高い SHM 負担 (変異 CLL、M CLL)6,7。具体的には、ほとんどまたはまったく SHM と clonotypic IGHV 遺伝子の場合成っていた U CLL グループおよびそれ故に最も近い生殖 IGHV 遺伝子 (≥98%)、高 % のアイデンティティ M CLL から成っていた高い突然変異荷重症例に対し (パーセントの id、最も近い生殖 IGHV 遺伝子 < 98%)。これらの初期の研究からそれが継続的には実証されて U CLL 例が短い時間に最初の治療 (TTFT) と M CLL と比較して全生存期間 (OS) を表示すること。
後知恵で、これらの種子の研究強調 B 細胞の受容器 (BcR) IG CLL の病理学のための道筋の極めて重要な役割広範な研究を順番より包括的な円高につながった CLL 内微小環境の相互作用にこの疾患8,9の生物学的多様性。最近の研究は、個々 のケースがクラスターのサブセット (準) 同一 BcR IG 遺伝子を共有しているために明らかにして CLL の免疫遺伝学的解析の重要性追加のサポートを提供している、現象と呼ぶ BcR IG 常同症10 ,11,12,13。プロパティに割り当てる同じステレオタイプ化されたサブセット港と同様 clinicobiological 明確に異なる IG 遺伝子シーケンスに対して、同じ SHM カテゴリ内他 CLL 患者からそれらを分離する患者が概念をサポートする証拠の蓄積確かに、U CLL または M CLL グループ14,15,16,に CLL 患者の一括分離を BcR IG 常同症さらに基づく CLL 患者の分類に精製報告されています17,18,19,20。
臨床的観点からは、SHM ステータス clonotypic IGHV 遺伝子の誘導に固有の応答と相関するようであることは注目に値するです。特に、M CLL 患者におけるフルダラビン/シクロホスファミド/リツキシマブ (FCR) の併用治療、 TP53遺伝子欠陥を欠けている医学的に不適当の CLL の患者のための金本位治療展示大幅に長く無増生存 (PFS) と同じ治療21,22,23を受けた U CLL 患者と比較して OS。したがって、SHM 状態の同定が重要になって特に CLL 患者などの治療管理の予測マーカーを支援ではなく、病気などの臨床経過を評価するため、予後マーカー。実際には、CLL 国際ワーク ショップから nci ガイドラインの最近の更新によると再配置の IGHV 遺伝子の SHM 状態する必要があります CLL の場合一般的な実践の両方で治療開始前に決定し、臨床試験24。また、新規処理剤及び試験で薬剤の数の増加の最近の承認により免疫グロブリン分子の SHM 状態は近い将来5CLL の患者の治療の管理にも大きな役割を果たす可能性があります。
このレポートは、IG 遺伝子のシーケンス解析、適切な材料を選択すると、シーケンスの結果の臨床的解釈で最高潮に達する開始のすべての側面を詳しく説明します。これらの手順の詳細な評価は、診断ルーチン臨床試験内正確な患者層別化を確保するため信頼性の高い結果の生産のために重要です。IG 遺伝子のシーケンス解析、結果、異なる研究室の中で比較しないように調和を支援するプロトコルが提供されます。
Protocol
研究計画書は、サン ラッファエッレ科学的な所、ミラノ、イタリアの倫理委員会で承認されました。 1. 材料の選択 開始材料の選択注: CLL のほとんどの場合腫瘍細胞数は診断で高い (> 80-90%)。したがって、セルの並べ替えまたは白血病細胞の濃縮通常必要はありません。 末梢血 (PB) を使用すると、IG 遺伝子配列解析のための選択の最も一般的な材料は 10-20 mL の血液量を使用します。 また、CLL 細胞負荷の低い場合、セルソート PB サンプルや骨髄 (BM) やリンパ節 (LN) のような他の組織から材料を使用します。 サンプリング時間 サンプリング時間は重要な IG SHM 状態が安定した超過作業時間;つまり、CLL 細胞数が少ない可能性があります分析を複雑にして、信頼性の低い結果につながるので直後後や治療中など一定期間でサンプリングを行わない。 材料の収集と保存注: は開始材料の採取、保存、材料の選択に強くに依存します。 鉛や BM のサンプルの PCR 増幅プロセスの阻害を防ぐために EDTA または CPT (クエン酸-トリス-pyridossalphosphate) コレクション チューブを使用します。また、ヘパリン管を使用します。 LN サンプル コレクション オプションがどちらの細胞懸濁液、新鮮凍結組織から、または、まれにホルマリン固定パラフィン包埋 (FFPE) 組織の生検です。 2. 密度勾配分離 注: 鉛や BM は最も頻繁にシナリオの選択の開始材料である密度勾配分離を使用して単核のセル隔離が推奨です。 EDTA を 200 μ l 添加 (0.5 M の EDTA/pH 8.0) 50 mL 滅菌採取管に。PB と RPMI 15 mL 20 mL を追加します。ピペッティングでミックス (2 〜 3 回で十分です)。 密度勾配媒体の 15 mL を 50 mL の新しいコレクション チューブに追加します。注: 場合 PB ボリュームは 20 mL 未満、RPMI (手順) と密度勾配のボリュームが適宜変更されます。 グラデーションは中断されませんので、ゆっくりステップ 2.1 からソリューションのレイヤーします。遠心分離機 800 x g で 20 分間遠心ブレーキをオフ。 上部プラズマ/血小板層と滅菌パスツール ピペットを用いた密度勾配媒体層の間を形成している単核細胞のリングを収集し、15 mL の滅菌採取管に転送。 12 mL の最終巻に RPMI を加え、混ぜます。8 分の 750 × g で遠心分離機します。上清を捨てます。 RPMI の 10 mL を使用して細胞ペレットを再懸濁し、2.5 の手順を繰り返します。 1 mL の PBS (DPBS、ないカルシウム、ないマグネシウム) の細胞ペレットを溶解します。サンプルの 20 μ L と 1:10 の 80 μ L を混合することによってノイバウアー プレートを使用してセル数を数えるためトルコのソリューション。 サンプルの下流の処理は、その日の予定はありません、8 分間 750 x g でサンプルを遠心します。上澄みを廃棄し、-80o c 以上で細胞ペレットを格納 3. 核酸抽出 IG 遺伝子の SHM 状態の解析のための基板を決定します。逆のトランスクリプション ステップのための必要性がないので、ゲノム DNA (gDNA) は最も人気のある選択肢です。また、RNA/相補的 DNA (cDNA) の使用、少なくとも転写レベルで生産性の高い、機能的な clonotypic IG 転位はなります「支持」のターゲット。 GDNA または合計の RNA の抽出に適した多数の市販キットの 1 つと cDNA の合成を使用 (材料の表を参照してください)。 DNA や RNA の敏感な核酸の定量化システムを使用しての整合性を評価します。例えばレチノイン酸受容体 α (ララ)、知られているハウスキーピング遺伝子の PCR 増幅による抽出された gDNA/cDNA の量と質を評価、分析用 FFPE 素材を使用して場合β-アクチン等。 4. 増幅と IGHV-IGHD-IGHJ 遺伝子再構成のシークエンス IGH PCR プライマーの選択 好ましくは、IGHV サブグループ特定 5′ プライマーと IGHJ 遺伝子特定 3′ プライマー25,26マルチプレックス PCR を実行します。結果が最適の場合は、単一の IGHV サブグループ特異プライマーを使用して別の PCR ミックスを準備します。 5′ に位置するリーダー地域いずれかにアニールするプライマーを使用して IG 転位または IGHV 遺伝子のコーディング領域 (例えばフレームワーク 1、FR1) 内すぐ上流。 全体の増幅を可能にする使用リーダー プライマーは、順番 SHM レベルの高精度な推定を可能にする IGHV-IGHD-IGHJ 遺伝子の塩基配列を再配置されます。したがって、IGHV リーダーのプライマーは、IG 遺伝子のシーケンス解析27の最新ガイドラインでエリックが推奨されます。 リーダーのプライマーが clonotypic IG 転位を増幅する失敗の場合、IGHV FR1 のプライマーを使用します。ただし、フレームワークのプライマーは、SHM のレベルの不正確な決定につながる可能性があります全体 clonotypic IG 遺伝子再配列を増幅されていません。このシナリオで、最寄りの生殖細胞系列の遺伝子を正体パーセント IGHV FR1 プライマーの使用を過大評価、臨床報告の状態を明確にします。 3′ 末端、IGHJ 遺伝子、IGHJ 遺伝子特定のプライマーまたは基板によって、アイソタイプ特異プライマーの多重セット コンセンサスのプライマーを使用します。プライマー シーケンスは、表 1、図 1に示しますプライマーアニー リングのさまざまな場所に対しで提供しています。 IGHV-IGHD-IGHJ 遺伝子再構成の PCR の拡大 公平な増幅を確保するため各サブグループ primer(s) の等モルの量を使用してプライマー ミックスを準備します。 たとえば、リーダーのプライマーを使用して、2 つの異なるプライマーは IGHV1 サブグループに属する再配列を増幅する使用します。したがって、IGHV4 サブグループ再編成の唯一のプライマーである IGHV4L と比較して半分にあるこれら 2 プライマー (IGHV1L と IGHV1bL) の量を使用します。 IGHJ1 2、IGHJ4 5 のプライマーの場合逆のアプローチを適用します。これらのプライマーは、2 つの異なる IGHJ 遺伝子のサブグループをターゲット、IGHJ3、IGHJ6 のプライマーと比較して量を倍します。 表 1を使用して、関連するプライマー ミックスを準備するとき正確なプライマー量を決定します。 ミックス PCR 試薬の表 2に記載されています。PCR チューブ PCR 試薬をすべて組み合わせることで後、Taq のポリメラーゼの 0.5 μ L と 100 追加 gDNA または cDNA の 2 μ L の ng (cDNA は、RNA の 1 μ g を使用して準備する必要があります)。注: 校正活動の Taq の酵素は増幅エラー率は非常に低いと SHM のレベルを与えないため必須ではありません。 表 3に詳細な熱の PCR のプロトコルを実行します。 クロナリティ注: PCR の製品のクローナリティ パターンの評価で重要な次のステップが含まれます。クローナリティ CLL 患者を評価する際、最も一般的な検索は単一、モノクローナル ピーク/バンドです。 クローナリティ評価28,29のフラグメントまたはヘテロ二本鎖の分析など、高感度メソッドを使用します。 フラグメント解析 マルチプレックス Pcr 5′ ラベル IGHV リーダーまたは FR1 サブグループ特異的 PCR プライマー; を使用してを実行します。キャピラリー電気泳動による分離できる PCR の製品が得られる、に基づいて行え、クロナリティ IGH PCR の製品の IGHV 相補性領域を特定する 3 (CDR3) 長さ。 プライマー、試薬およびそれら前述 (表 1-3 を参照) と同じ温度条件を使用します。カスタムの 5´ のプライマーを標識蛍光 5′ 端に染料の選択と oligos のラベルです。レポーター色素 6 FAM、六角、ネッドやテトがあります。したがって、2 別の反応は、反応あたり 3 異なる染料の使用に基づいて必要があります。 1 を使用して (この割合の最適な解像度の結果)、6% (6%) ポリアクリルアミドゲル、PCR の製品のサイズを評価実行バッファーとして x TBE。80 で 45 分のための V。注: PCR の製品が、モノクローナル抗体サンプルはポリクローナルの背景から分離できるし、DNA サイズ マーカーを十分に分離できる十分な時間のゲルに移行することをお勧めします。ゲルの厚さ、サイズなどの要因は、45 分の 80 V で電圧の設定は良い出発点も移行するサンプルのリスクを最小限に抑える最良の結果を保証できる (電圧と時間) の 1 つの設定はありませんので移行に影響することができます。ゲルを迅速に「実行中」オフ。 IGHV FR1 プライマー ミックスを使用する場合、約 500 塩基対 IGHV リーダー プライマーを使用する場合と 350 塩基対の PCR 産物を確認します。注: まれに、CLL 例発見されているダブル、モノクローナル抗体の製品を運ぶため、ケースも稀である場合は、オリゴグローナル パターンを示すことがあります。紫外励起または青色光を用いたアクリルアミドゲルの DNA の可視化の危険とより敏感の市販 DNA 汚れ以下臭化エチジウム (EtBr) などのデュアルインターカレーション エージェントを使用できます。 PCR の製品の浄化注: PCR の製品はプライマーと同様、CLL サンプル内の通常の B 細胞由来ダイマー最適シーケンスにつながる可能性があります任意の polyclonal の背景を削除する精製しました。未採用 dNTPs と酵素の処理、例えばSap (エビのアルカリホスファターゼ) など、PCR – クリーンアップのためのプライマーを削除する任意のメソッドを使用して/エキソ (エキソヌクレアーゼ私)、または列に基づく浄化。 3% 低融点アガロースゲルに PCR の製品の合計ボリュームをロードします。 ゲル上で背景から離れるまで、PCR の製品を許可します。 シャープ、著名な PCR バンドを消費税、浄化し、溶出します。2 再編成が検出された場合、両方のバンドは切除する必要があり、別々 のシーケンスします。 Sap/エキソ-クリーンアップを実行するには、; を使用する特定のボリュームに関する製造元の指示に従います典型的な反応は、1 μ L を含めることができますただし、Sap 0。5 μ L あたり 5-10 μ L の PCR 反応バッファーの Exo と 2 μ L 5 x インキュベーション。軽くボルテックスによって各サンプルをミックスし、PCR ブロック 37 ° C で 30 分間インキュベートします。15 分の 85 ° C に加熱することにより酵素を不活性化します。 製品の純度を評価するために 3% の agarose のゲルの PCR の製品の少量をロードします。 5. サンガー シーケンス 注: 戦略の存在、しかし、正確なアプローチは、直接両方のストランドの配列に関係なくいくつかのシーケンスは、信頼性の高い結果を保証するのに必須です。 一般的なシーケンス プロトコル 1 つのプライマーを用いて増幅が実行された場合は、適切な IGHV – と IGHJ – または一定の地域固有のプライマーを使用してシーケンスを続行します。多重蛍光標識プライマーを使用しているし、PCR の製品は、フラグメント解析 (配列のプライマーがラベルなし) を使用して査定された場合にも、この方法を適用できます。 場合多重プライマーが使用されているクローナリティのゲルに評価された、使用下流のプライマー シーケンス例えばコンセンサス IGHJ プライマーの最初のステップで 5′-GTGACCAGGGTNCCTTGGCCCCAG-3 をされているシーケンスを持つ ‘。また、cDNA を基質として使用した場合は、CH プライマーを使用できます。次に、2 番目のシーケンス処理手順のサブグループ特異 IGHV リーダーまたは FR1 のプライマーを使用します。 例シーケンス プロトコル注: いくつかのシーケンス プロトコルが存在して例のプロトコルは下記します。 33 を希釈量 11.5 μ L の滅菌水などを使用して、PCR の製品の ng。5 分間 95 ° C の加熱により PCR の製品を変化させなさい。すぐに二次構造の形成を防ぐために 10 分間氷の上を配置します。 0.5 μ (5 pmol に対応)、プライマーと一緒に各チューブにマスター ミックスの 8 μ L を追加します。 コントロールとして 9.5 μ L の滅菌水 2 μ L (-) 47 配列のプライマー、0.5 μ L pUC18 コントロール テンプレートのマスターの組合せの 8 μ L を含むチューブを準備します。各チューブの最終的な総ボリュームは 20 μ L をする必要があります。 表 4に示すとおりシーケンス反応熱サイクリング条件を使用します。 酢酸ナトリウム (pH 5.2) 3 M 2 μ L の 2 μ L を混合することによって停止ソリューションを準備 EDTA 100 Mm (pH 8.0) とグリコーゲンの 1 μ L (濃度 20 mg/mL)、各サンプルに 5 μ L を追加。製品を新しい微量遠心チューブに転送します。 100% エタノール (-20 ° C) 60 μ L を加え、軽く混ぜます。15 分 (4 ° C) の 14,000 rpm で遠心分離機します。上清を捨てます。 70% エタノール (-20 ° C) の 100 μ L を加え、軽く混ぜます。遠心分離機の 14,000 rpm で 10 分間 (4 ° C)。上清を捨てます。もう一度繰り返します。 室温で 90 分のペレットを乾燥させます。40 μ L のナトリウム dodecyl 硫酸塩 (SDS) ソリューション各サンプルに追加します。 シーケンス プレートにサンプルを転送、ストリップ キャップやテープ ・ シールでカバー、マシンにロード、サンガーを実行シーケンス。シーケンス プレートは通常 96 ウェル、v 底、シーケンサーとの互換性フル スカート PCR プレートです。プレートは、シーケンスが社内に実行されるかどうかに応じて、商業会社、または学術シーケンス センター/プラットフォームでバーコードがあります。 シーケンス処理の後 ‘ 一緒にステッチ ‘、完全な IGHV 遺伝子再配列すなわち、コンセンサス配列を形成する個々 のシーケンス ステップから生成された 2 つの読み取り。 6. シーケンス解析 注: 次のセクションを分析する際に、IMGT/V-クエスト ツール30から得られる出力焦点並べ替え IG シーケンス、および IMGT/JunctionAnalysis31、ともに臨床報告と研究のために特に関連研究。IMGT/V-クエストはユーザーを比較する配置ツール提出 IG シーケンス IMGT 参照ディレクトリを30に設定します。ツールの出力には、ユーザーが特定のパラメーターを定義できるいくつかのセクションが含まれています。 種、例えば、ホモ ・ サピエンス(ヒト) と受容体型または軌跡 (例えばIGL や IGK IGH) を指定します。 (最大 50 シーケンスごとに実行の単位) のテキスト領域にして FASTA 形式のヘッダーなどに分析されるシーケンスを貼り付けます。また、FASTA シーケンスを含んでいるローカルファイルへのパスを入力するためのオプションが提供されます。 結果を次の 3 の表示オプションのいずれかを選択します。 詳細表示: 各シーケンスの結果を個別に取得するためにこのオプションを選択します。 合成表示: IGHV 遺伝子および対立遺伝子名またはシーケンス入力順を命じた概要テーブルをコンパイルするこのオプションを選択します。このオプションは、すべての送信されたバッチで、同じ IGHV 遺伝子および対立遺伝子に割り当てられているシーケンスの配置を提供します。 Excel ファイル: 単一ファイルに組み込まれるスプレッドシートとしてすべての出力ファイルを提供するためにこのオプションを選択します。すべての表示オプションから、ただし選択する基本的な高度なパラメーターの大きい選択がある CLL IG シーケンス解析に最も関連する要因だけで ‘代表結果’ セクションで論議されます。 7. 逮捕/AssignSubsets ツール CLL (詳細は下記 ‘代表 ‘ の結果セクションの) 内で BcR IG を常同症を調べるためには、逮捕/AssignSubsets ツール32IGHV IGHD IGHJ FASTA シーケンスを送信します。ツールは、主要な CLL に割り当てのステレオタイプのサブセットを報告します。逮捕/AssignSubset ウェブサイト32と [サービス] タブの下のエリック ウェブサイト詳細な手順と共にサブセット割り当てツールがあります。
Representative Results
次の例は、上記手順の詳細な IG 遺伝子配列解析から得られた結果を示しています。DNA ・ RNA 抽出がほとんどの臨床/研究所のルーチンの手順、gDNA や高感度分光光度計または他の適切なテクノロジを使用して RNA の品質/数量チェック最初の重要なステップが含まれます。次の重要なステップには、clonotypic IGHV-IGHD-IGHJ 遺伝子再配列の PCR の拡大が含まれます。IGHV リーダー プライマーの使用のみにより未定; 実際の SHM 負荷が可能、再配置の IGHV 遺伝子の塩基配列の完全な長さの増幅、前述のように、したがって、IGHV リーダーのプライマーは、推奨のプライマーの選択 (図 2)。まれに IGHV リーダー プライマーが clonotypic IG 転位を増幅できない、IGHV FR1 プライマーを使用できます。図 3からわかるように、いくつかの PCR の製品/バンド現れることがあります、特に gDNA が原料。これらのバンドは切除する必要があります、個別のシーケンスします。IGHV リーダーと IGHV FR1 プライマーが結果をもたらすに失敗した場合、新しい患者サンプル (可能な場合) を使用して、解析を繰り返してください。シーケンスの前に最後のチェックポイントのフラグメント解析 (図 4) を使用してサンプルのクローナリティ決定です。 系列は、IMGT/V-クエスト ツール30を使用して分析する必要があります。ユーザーが選択したパラメーター、軌跡、挿入、および削除のオプション等の検索や受容体型種と分析・ シーケンスの数と共に一覧で示します。各 FASTA シーケンスが表示され IMGT/V ・ クエストによって分析 V-ドメインは緑色で強調表示されます。また、入力シーケンスの向き (アンチセンス) 場合、プログラムが自動的に補足逆シーケンスを提供します、これの状態の FASTA シーケンス上。 概要テーブルは FASTA シーケンスの詳細な表示の上部に、直接下記結果結果ページと CLL の IG 遺伝子配列解析の臨床報告の重要な情報が含まれています。このテーブルの各行は、次のとおりです。 結果の概要です。結果テーブルの最初の行の状態入力シーケンスの機能: IG の並べ替え順序は、生産または非生産的なをすることができます (図 5 a 及び 5 b)。IG 遺伝子の再配列は、挿入/削除によりアウト フレームで非生産的な場合停止コドンが (VH) の V D J 地域内または (VL) の V J 領域内に存在かどうか、転位があることです。3 分の 1 の出力機能を決定できない場合がありますつまり場合 IGHV IGHD IGHJ 接合を識別できませんでした。このインスタンスで、結果の概要は、’ない転位発見’ や ‘ないジャンクションが見つかりました’ として読むでしょう。生産にのみ注意してくださいすることが重要だし、したがって、機能再編成をさらに分析する必要があります。唯一 IG 転位を増幅した場合は機能しません (非生産的なまたは ‘ない転位が見つかりました’)、PCR 増幅のプロセスを繰り返す必要があります。結果が負の値場合新しい患者サンプルを取得必要があります。 V 遺伝子とアレル。’V 遺伝子および対立遺伝子’ の行は、最も近い生殖 IGHV 遺伝子とそのアライメント スコアとパーセントのアイデンティティの対立遺伝子を示します。いくつかの遺伝子、対立遺伝子は、同じ高得点を与える、すべてが一覧表示されます。提出されたシーケンスと最も近い IGHV 遺伝子対立遺伝子間パーセント id は、SHM ステータスが決定しますので特に重要です。この値は、CDR3 を除く V 領域の 3′ 末端に V の地域の最初の塩基配列から計算されます。IGHV FR1 プライマーを使用する場合プライマーの対応するシーケンスは、正確な可能な限り結果を保証するのに常に除去されるべき。注意すべきこと低 id のパーセンテージ (< 85%) 挿入あるいは削除によって生じる (後述)、これは場合をする必要があります '警告' 注はユーザーに警告する「結果の概要」列に表示されます。 J 遺伝子とアレル。前述の V 遺伝子・対立遺伝子上に、’J 遺伝子および対立遺伝子’ 行は最も近い生殖 IGHJ 遺伝子とそのアライメント スコアとパーセントのアイデンティティの対立遺伝子を示します。ただし、IGHJ 遺伝子はむしろ短いと exonuclease の作業のための 5′ 端が縮小、他の選択肢も連続した同一のヌクレオチドの最大数に基づいて、ツールによってが検索されます。 D 遺伝子と IMGT/JunctionAnalysis でアレル。いた遺伝子および対立遺伝子 IMGT/JunctionAnalysis ‘ によってユーザーの順序でツールによって識別される D 地域リーディング ・ フレームと最も近い生殖 IGHD 遺伝子および対立遺伝子を示します。IMGT/JunctionAnalysis31の接合部の詳細で正確な分析を提供します、IMGT/V-クエスト ツール インターフェイスに統合されています。このツールは、IGHD 遺伝子および対立遺伝子識別すなわち、 (i) D 領域の短い長さにリンクされている難易度のすべての側面を管理します。(ii) 2 あるいは 3 リーディング ・ フレーム; の使用(遺伝子; の両端 iii) exonuclease トリミングそして、(iv) 突然変異の存在。 FR IMGT の長さ、CDR IMGT 長さおよび AA ジャンクション。この行は、IGHV FRs と Cdr かっこ内に示されてし、区切られたドットとアミノ酸 (AA) の接合部の長さを提供します。接合部の AA シーケンスを示します (i) またはアウト-の-フレーム内転位 (フレーム アウトの位置は ‘#’ 記号で示されます)、終止コドンの (ii) の有無 (終止コドンがアスタリスクで表示されます ‘ *’)、および (iii) の有無、アンカーの VH CDR3-IMGT: C (2-CYS 104)、W (J TRP 118)。 体細胞の hypermutations は主に単一のヌクレオチドの変更で構成されます、しかし、小さな挿入と V 領域内で削除することができますで観察する、とはいえくらい低い周波数33。とき IMGT/V-クエストの既定のパラメーター、挿入および削除を使用して自動的に検出されません。によってシーケンスがこのような変化、すなわち、低パーセントのアイデンティティおよび/または送信されたユーザー シーケンスと最も近い生殖系列遺伝子および対立遺伝子、間の異なる IGHV CDR1 IMGT と CDR2 IMGT 長さを運ぶことができるという強い兆候を検出するただし、以下の結果概要表 (図 5) ツールと警告アラートが表示されます。 IMGT には、「結果表示」セクション下にある ‘高度なパラメーター」セクションで「挿入および削除検索」と呼ばれるオプションが用意されています。関連する警告が表示される場合、この機能を使用することをお勧めします。発見の包括的な詳細は、(i) を含む ‘結果の概要’ セクションで挿入または削除があるすなわち、 VH FR IMGT または CDR-IMGT; 削除と挿入が検出されると、(ii); ヌクレオチドの挿入/削除の数(iii) (挿入) のためにだけシーケンス(iv) かどうか、フレーム シフトが発生しました。(v) から挿入や削除を開始; V 地域コドン(vi) 提出に影響を受けたヌクレオチド位置シーケンス (図 5)。挿入、ツールは送信されたユーザーのシーケンスから、insertion(s) を削除し、標準の IMGT/V-クエスト パラメーターを使用してシーケンスを再分析します。削除が検出された場合、ツールは分析を繰り返す前に削除されたヌクレオチドを置き換えるにドットで表されるギャップを追加します。 臨床検査の実行、すべての診断や予後テスト、に関しては厳しい基準と高レベルの再現性は最も重要なが。IMGT/V-クエスト出力 CLL、すなわち、 (i)、IGHV、IGHD と IGHJ 遺伝子および対立遺伝子活用; の IG 遺伝子配列解析の結果を報告するために必要な情報の多くを提供しています。(ii) IGHV IGHD IGHJ 遺伝子転位などの clonotypic の機能かどうか再配置が生産的か非生産的な;(iii) 組みかえてのパーセントの id IGHV 遺伝子とその最も近い生殖 IGHV 遺伝子および対立遺伝子と比較して対立遺伝子。リーダーの監督 CLL、問題の解釈や技術的に困難な場合、CLL の IGHV 遺伝子の SHM 状態の正確かつ頑健な決定のための推奨事項の IG 遺伝子の臨床報告に関する包括的な詳細については、最近、エリックのガイドラインおよびレポート27,34を更新しました。 最後に、おかげで CLL BcR IG くまに関する成長知識、CLL の IG 遺伝子再構成の臨床報告を追加推奨要件はステレオタイプの主要なサブセットにケースの割り当てに関連します。それが推奨されて臨床レポートの状態分析生産性 IGHV 遺伝子再構成は、すなわちサブセット #1, #2、#4 または #812,27主要なステレオタイプ化されたサブセットのいずれかに割り当てることができるかどうか。主要なステレオタイプ CLL のサブセットに割り当てを実行して、逮捕/AssignSubsets ツール (図 6)32を使ってください。 5 ‘ IGHV FR1 プライマー プライマー シーケンス プライマー ミックス 60 μ L の量 IGHV1 CAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGG 10 IGHV2 CAGGTCAACTTAAGGGAGTCTGG 10 IGHV3 GAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGG 10 IGHV4 CAGGTGCAGCTGCAGGAGTCGGG 10 IGHV5 GAGGTGCAGCTGTTGCAGTCTGC 10 IGHV6 CAGGTACAGCTGCAGCAGTCAGG 10 5′ IGHV リーダー プライマー IGHV1L AAATCGATACCACCATGGACTGGACCTGGAGG 5 IGHV1bL AAATCGATACCACCATGGACTGGACCTGGAG(C/A) 5 IGHV2aL AAATCGATACCACCATGGACACACTTTGCT (A/C) AC 5 IGHV2bL AAATCGATACCACCATGGACATACTTTGTTCCAC 5 IGHV3aL AAATCGATACCACCACCATGGAGTTTGGGCTGAGC 5 IGHV3bL AAATCGATACCACCACCATGGA(A/G)(C/T)T(G/T)(G/T)G(G/A)CT(G/C/T) (T/C) GC 5 IGHV4L AAATCGATACCACCATGAAACACCTGTGGTTCTT 10 IGHV5L AAATCGATACCACCATGGGGTCAACCGCCATC 10 IGHV6L AAATCGATACCACCATGTCTGTCTCCTTCCTC 10 3′ IGHJ プライマー IGHJ1 2 TGAGGAGACGGTGACCAGGGTGCC 20 IGHJ3 TGAAGAGACGGTGACCATTGTCCC 10 IGHJ4 5 TGAGGAGACGGTGACCAGGGTTCC 20 IGHJ6 TGAGGAGACGGTGACCGTGGTCCC 10 表 1。プライマー シーケンスと clonotypic IGHV IGHD IGHJ 遺伝子再配列の PCR の拡大量。 試薬 ボリューム (μ L) 10 バッファー x RB 5 MgCl2 (50 mM) 3 dNTPs (10 mΜ) 2 プライマー IGHV リーダー/FR1 ミックス (10 μ M) 3 プライマーの IGHJ ミックス (10 μ M) 3 H2O 31.5 総容積 47.5 表 2。Clonotypic IGHV-IGHD-IGHJ 遺伝子再配列の pcr 用試薬です。 温度 期間 サイクル数 説明 94 ° C 5 分 1 ポリメラーゼ活性化 94 ° C 1 分 39 変性 59 ° C 1 分 アニール 72 ° C 1.5 分 拡張機能 72 ° C 10 分 1 最終的な拡張 18 ° C ∞ 1 保全 表 3。Clonotypic IGHV-IGHD-IGHJ 遺伝子再配列の pcr の熱サイクリング条件です。 温度 期間 サイクル数 説明 94 ° C 5 分 1 ポリメラーゼ活性化 96 ° C 20 秒 30 変性 50 ° C 20 秒 アニール 60 ° C 4 分 拡張機能 4 ° C ∞ 1 保全 表 4。IG 遺伝子シーケンス反応の熱サイクリング条件です。 図 1。様々 なプライマーアニー リングの示された場所に IGHV IGHD IGHJ 遺伝子再構成の略図。5′ IGHV プライマーをアニール IGHV コーディング シーケンスの上流に位置するリーダー シーケンスに。5′ IGHV フレームワーク (FR) プライマーをアニール再配置の IGHJ 遺伝子の末尾に 3′ IGHJ プライマーがアニールに対し再配置 IGHV 遺伝子内にある FR1 領域の先頭に。UTR: 非翻訳領域。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。 図 2。7 患者サンプル 5′ IGHV リーダーのプライマーを使用して IGHV-IGHD-IGHJ 遺伝子再配列の PCR 増幅します。8 レーン 9 レーンに PCR のための否定的なコントロールが読み込まれたに対し肯定的な制御を表します。予想される PCR の製品は、IGHV リーダーのプライマーを使用して約 500 塩基対のサイズです。ゲルの最後の列にアスタリスクは、100 bp の DNA の梯子を示します。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。 図 3。IGHV FR1 プライマーを使用して患者の 13 のサンプル IGHV IGHD IGHJ 遺伝子再配列の PCR 増幅します。14 レーンには、否定的な制御は 15 レーンに読み込まれたしながら肯定的な制御が含まれています。レーン 2 の DNA が出発原料の証明としていくつかの PCR バンド観察される、摘出する必要がありますし、別々 のシーケンスします。5、7、および 13 のレーンでサンプル成果ポリクローナル (ゲルの汚れによって証明される)、従って、PCR のステップを繰り返す必要があります。第 2 PCR が並べ替え IG を増幅する失敗した場合は、遺伝子解析を新しいサンプルに (可能な場合) 実行する必要がありますか設定異なるプライマーを用いたします。予想される PCR の製品は、IGHV FR1 プライマー ミックスを使用して約 350 塩基対のサイズです。ゲルの最後の列にアスタリスクは、100 bp の DNA の梯子を示します。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。 図 4。Genescan 解析を用いたクローナリティの評価します。Genescan におけるモノクローナル抗体の PCR の製品は製品サイズ (下段) の詳細分布が発生するポリクローナルの PCR の製品に同じサイズ (上部パネル) の蛍光製品の支配的なピークに上昇を与えます。赤のトレースは分析されるサンプルとして同じ毛細血管注入に読み込まれている蛍光標識した DNA の梯子からピーク。サイズ標準の断片のサンプルと同じ電気泳動の力を受けるが、したがって同じ噴射条件にさらされています。サイズ標準の断片の一定の間隔は、正確なサイズの呼び出しを確認します。青のトレースを表すモノクローナル抗体 (上部パネル) またはポリクローナル (底板)、サンプルの性質。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。 図 5。IMGT/V ・ クエストによって提供される結果の要約テーブルの例です。(A) (ない停止 codon(s) とフレームのシーケンス ジャンクション) の生産的な IGHV IGHD IGHJ 遺伝子再構成の結果一覧の表。V 遺伝子の対立遺伝子と J 遺伝子対立遺伝子 IMGT/V ・ クエストによってユーザーの順序で識別されるこの場合 IGHV4-34 * 01 と IGHJ6 は、* 02 (に基づいて最高のアライメント スコアの評価)。パーセント id は、単一の体細胞突然変異による 99.65% です。D 遺伝子および対立遺伝子の IMGT/JunctionAnalysis によって識別される、フレーム 1 を読んで IGHD3-3 * 01。4 フレームワーク領域 (FRs) として 3 つの相補性決定領域 (Cdr) の長さは、角かっこで示されます。IGHV D J ジャンクションのアミノ酸 (AA) シーケンスがあります。この例では接合部で構成されています 22 原子吸光法。(B)結果サマリー テーブル アウト フレームの接合による生産的ではありません IGHV-IGHD-IGHJ 遺伝子再配列シーケンス.CDR3 IMGT 長さ X は、このシーケンスの長さを特定できませんでしたを示します。’#’ は AA ジャンクション シーケンスにおいては、フレーム シフトを標識します。(C)結果サマリー テーブル低 V 地域アイデンティティ (60.94%) の警告と、「パラメーターの詳細」セクションで「挿入と削除」オプション使用することを示します。(D) 「挿入と削除の検索」オプションを使用してシーケンス解析を繰り返し後 (C) に示す生殖低パーセント id を持つケースの結果一覧の表。正しい id % は、括弧付きで表示、単一の変異イベントとして挿入を考慮した計算されます。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。 図 6。逮捕/AssignSubsets のツールによって生成されたサブセットの割り当てレポート テーブル。10 CLL 患者 (A1 A10) から FASTA IG シーケンスは、逮捕/AssignSubsets ツールに堤出されました。ケース A4 は、信頼性の高さがサブセット CLL ステレオタイプ #2 (このグループ内の患者は、SHM 負荷に関係なく予後が不良と知られている) に割り当てられていた。7 その他のケース/シーケンスのない主要なステレオタイプ化されたサブセットに割り当て、それゆえ未割り当てとして分類されます。提出されたシーケンス (A7 と A8) の 2 つはサブセットの割り当てに使用できませんでした、代わりにシーケンス、すなわち、アウト フレームの接合部または終止コドンの存在するためスキップ/不健康な問題が原因として分類されていました。表の見出しとツールの包括的な説明は32逮捕/AssignSubsets のウェブサイトで利用できます。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
Discussion
CLL の IG 遺伝子の研究は、だけでなく疾患病態により良い理解を提供するため、また患者のリスク層別化を改善するために重要されている.したがって、IG 遺伝子配列解析のマルチ ステップの手順とシーケンス データのそれに続く解釈が標準化された方法で実行されることが重要です。適切かつ十分な患者材料の可用性、およびサンプリングのタイミングは PB と高 CLL 腫瘍細胞数と任意のサンプル テストを実行することができますので、IG 遺伝子変異解析を実行する能力に影響する必要があります。勾配分離方法を使用して血単核細胞の分離は、診断研究所で行われる日常的に、いつものようにケアをグラデーションを含むチューブに血液/RPMI ソリューションを追加するときに取られるべきこの作業は、グラデーションを妨害を避けるために、細胞の損失を防ぐためにゆっくりと、穏やかな方法で実行する必要があります。
次の細胞分離、核酸を抽出します。両方の cDNA と gDNA SHM clonotypic IGH の転位の解析に適しています、しかし、どちらかの材料の使用の長所と短所があります。PCR の拡大の前に実行される逆のトランスクリプションを持たないので gDNA を使用するとき、研究室ワークフローは速く進みます。言われて、順番に、追加の実践的な研究作業、すなわち、浄化または複数の PCR の製品のゲル切り出しにつながることができる生産的かつ非生産的な語順換えの増幅 PCR 用基板として gDNA を使用してすべて再編成の個々 のシーケンス。CDNA と gDNA アプローチを比較すると、後者逆のトランスクリプション ステップ実行する必要が前に PCR の拡大。ただし、ほとんどの場合、このインスタンスの生産的な IG 再編成のみ増幅されその後シーケンスします。したがって、PCR の製品は 1 つだけを精製した、シーケンス、結果の解釈はより簡単ですが。
増幅の効率は、敏感な定量化と利用したプライマーを使用して査定されるべき gDNA/cDNA の質によって大きく異なります。使用されるプライマーは、SHM レベルの正確な測定は、再配置の IGHV 遺伝子の全体のシーケンスを増幅することによってのみ実現できますので全体の分析手順に重要です。フルレングスの転位は、エリックの推奨事項は、最近の使用のリーダー プライマー27を正当化するため、5′ IGHV リーダーのプライマーを使用する場合にのみ評価できます。不完全な IGHV-IGHD-IGHJ 遺伝子の語順換えの増幅につながる代替のプライマーの使用 IGHV 遺伝子変異解析には適していません、したがってに対して強く助言します。唯一の例外は IGHV リーダーのプライマーを使用する場合、繰り返し否定的な結果を生成する場合に関連し、新しい患者材料の解析がされていない可能かもしない結果が得られない。原因は腫瘍細胞量が低すぎると、リンパ球増加は、原因が CLL クローンかもしれない別患者の検体や材料 (gDNA/cDNA) および様々 なプライマーの使用は、PCR の製品を生産するはまだ失敗を設定する場合 (その場合、イムノフェノ タイプする必要があります再評価される)。分析のために使用されるプライマーは、臨床レポートで常に記載すべき。
CLL は IGHV-IGHD-IGHJ 遺伝子再構成は、同じ単クローン性 B 細胞の蓄積の結果、大多数の場合クローナリティの評価を明らかにするユニークなモノクローナル抗体ピーク、すなわち、単一のクローン。まれに、ダブル再編成またはオリゴグローナル パターンも生じることが35。このような場合は、ゲルの電気泳動は、クロナリティのため最寄りの方法とフラグメント解析などのより敏感な方法を適用する必要があります。一度クローナリティを確認すると、シーケンスの前に最後のステップ シーケンスの高品質が得られることを確保するため PCR の製品の浄化に関連します。最後に、IMGT/V-クエスト ツールはエリックが IG シーケンス解析の推奨リソースです。IMGT データベースが常に更新され、一貫したとも注釈の方法の結果を報告このツールにより、標準化された分析、臨床や学術の施設間での比較分析が容易になります。
CLL の免疫遺伝学的解析、予後と、特に予測への影響、主要な CLL に割り当てを含む IGHV-IGHD-IGHJ 遺伝子再構成のロバスト解析ステレオタイプのサブセット、はやだけ望ましいが重要な鍵です。これは特に明らか治療薬、免疫グロブリン遺伝子解析が治療決定5,21,22,23,36,37 をガイドしている潜在的なこの時代に ,38, CLL24国際ワーク ショップから nci ガイドラインの最近のアップデートで公式に示されます。厳格な基準が保証されます、特に、clonotypic の SHM 状態の定量は、CLL の患者における IGHV 遺伝子を再配置、些細な問題ではないと複数の手順が含まれます。重要なは、特定の実験の手順、特にプライマー、特定のオプションやアプローチ、優れた結果が得られますの選択が守られて、他の技術的な側面は、材料の選択などの柔軟性のある程度または、場合は、最終的な結果について、彼らは微妙な違いにつながるという事実のために、クローナリティを評価するための方法。
最後の 10 年間、エリックは、標準化と CLL の診断および前兆に関連するさまざまな方法の調和を促進するために努めて参りました。これは出版された推薦と免疫遺伝学的解析27,34, 多くの整頓されていた教育ワーク ショップやイベントに専門家のオンライン フォーラムと同様、IG ネットワークの確立のためのガイドラインに反映されます。話し合うし、CLL の IG 遺伝子シーケンスの解釈に関するガイダンスを提供します。これらのアクションによってエリックの全体的な目標は、最適な診療と患者のケアを促進するためです。強烈な努力にもかかわらずこのタスクは、程遠いですし、実は免疫プロファイリングを目指した新規高スループット シーケンスの開発により複雑になっています。それにもかかわらず、課題を永続化、CLL の IG 遺伝子解析の堅牢な標準化のための集中的な努力を続ける、エリック内で継続的な活動の焦点は、現在。
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
私たちは彼らのコミットメントと CLL に免疫遺伝学の研究に熱意の研究グループ、IgCLL グループとエリックは、現在と過去のメンバーに感謝します。また全員 IMGT/CLL-DB イニシアチブと、特に、教授マリー = ポール ・ Lefranc と Dr ヴェロニク Giudicelli、d’Immunogenetique らが参加した Moleculaire、LIGM、大学の信頼のコラボレーションを認識したいと思いますモンペリエ II、モンペリエ、フランス、IMGT、国際学会情報システムは、彼らの巨大なサポートし、IG 遺伝子のシーケンス解析に役立ちます。この作品は TRANSCAN 179 小説 JTC 2016 年; からの補助金によって一部にはサポートラ Ricerca スル Cancro AIRC (捜査官グラント #20246 および特別なプログラム分子臨床腫瘍学-5 パーミル #9965) あたり Associazione イタリア、ミラノ、イタリア;における地域再生戦略・ ディ ・ Rilevante インテレッセ ナツィオナーレ通り (プリント) # 2015ZMRFEA、MIUR、ローマ, イタリア;スウェーデン癌協会、スウェーデン研究評議会、クヌートとアリス バレンベリー財団、カロリンスカ研究所、ウプサラ大学、ウプサラ大学病院とライオンのがん研究振興財団、ウプサラ;オデュッセウスのプログラム、「アクションの戦略的な開発研究と技術分野」、オペレーション プログラム「競争力、アントレプレナーシップおよびイノベーション」によって資金を供給下で実施 (NSRF 2014 年-2020 年) ギリシャの協調融資と欧州連合 (欧州地域開発基金)。
Materials
| BD Vacutainer Plastic Blood Collection Tubes with K2EDTA: Tube Stopper | ThermoFisher scientific | 02-689-4 | material storage |
| BD Vacutainer CPT Mononuclear Cell Preparation Tube – Sodium Heparin | Becton Dickinson | 362753 | material storage |
| BD Vacutainer Heparin Blood Collection Tubes FAQ | Daigger Scientific | 366480 | material storage |
| UltraPure 0.5 M EDTA pH 8.0 | Invitrogen | 15575038 | cell processing |
| Centrifuge tubes 15 mL CS500 | Corning | 352096 | cell processing |
| Centrifuge tubes PP 50 mL CS500 | Corning | 352070 | cell processing |
| RPMI Medium 1640 (1X) liquid | Invitrogen | 21875-091 | cell processing |
| Ficoll-Paque PLUS, 6 x 100 mL | STEMCELL Technologies | 17-1440-02 | cell processing |
| Serological pipettes 5 mL | Sarstedt | 861,253,001 | cell processing |
| Serological pipettes 10 mL | Sarstedt | 861,254,001 | cell processing |
| Serological pipettes 25 mL | Sarstedt | 861,685,001 | cell processing |
| Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (D-PBS) (1X) | Invitrogen | 14190250 | cell processing |
| Neubauer plate | Marienfeld-Superior | 640010 | cell processing |
| Tuerk solution | Sigma-Aldrich | 93770 | cell processing |
| PureLink Genomic DNA Mini Kit | Invitrogen | K1820-01 | DNA extraction |
| QIAamp RNA Blood Mini Kit | Qiagen | 52304 | RNA extraction |
| AllPrep DNA/RNA Mini Kit | Qiagen | 80204 | DNA/RNA extraction |
| 5X first-strand buffer | Invitrogen | P/N Y02321 | cDNA synthesis |
| Random Primers, 20 µg | Promega | C1181 | cDNA synthesis |
| RNaseOUT™ Recombinant Ribonuclease Inhibitor | Invitrogen | 10777019 | cDNA synthesis |
| DTT | Invitrogen | P/N Y00147 | cDNA synthesis |
| SuperScript II Reverse Transcriptase | Invitrogen | 18064-014 | cDNA synthesis |
| 10 mM dNTP Mix | Invitrogen | 18427013 | cDNA synthesis, PCR |
| PCR Buffer | Invitrogen | O00065 | PCR |
| MgCl2 (magnesium chloride) (25 mM) | ThermoFisher scientific | AB0359 | PCR |
| Taq DNA Polymerase, recombinant | Invitrogen | 10342-020 | PCR |
| Applied Biosystems 5′ Labeled Primers | ThermoFisher scientific | – | PCR/Clonality assessment |
| Agilent High Sensitivity DNA Kit | Agilent Technologies | 5067-4626 | PCR product quantification |
| UltraPure TBE Buffer, 10X | ThermoFisher scientific | 15581044 | gel electrophoresis |
| UltraPure Ethidium Bromide, 10 mg/mL | ThermoFisher scientific | 15585011 | gel electrophoresis |
| SYBR Safe DNA Gel Stain | ThermoFisher scientific | S33102 | gel electrophoresis |
| 10X BlueJuice Gel Loading Buffer | Invitrogen | 16500100 | gel electrophoresis |
| DNA Ladder 1000 bp/1 kb ladder BLUE ready-to-use | Geneon | 305-105 | gel electrophoresis |
| UltraPure Agarose | ThermoFisher scientific | 16500500 | gel electrophoresis |
| Agarose low gelling temperature | Sigma-Aldrich | A9414-250G | gel electrophoresis |
| Novex TBE Gels, 10%, 10 well | ThermoFisher scientific | EC6275BOX | gel electrophoresis |
| ExoSAP-IT PCR Product Cleanup Reagent | ThermoFisher scientific | 78201.1.mL | PCR product clean-up |
| QIAquick Gel Extraction Kit (50) | Qiagen | 28704 | PCR product clean-up |
| GenomeLab DTCS Quick Start Kit | Beckman Coulter | 608120 | Sanger sequencing |
| Sodium Acetate Solution (3 M), pH 5.2 | ThermoFisher scientific | R1181 | Sanger sequencing |
| Glycogen, molecular biology grade | ThermoFisher scientific | R0561 | Sanger sequencing |
| Ethanol absolute | EMD Millipore | 1024282500 | Sanger sequencing |
| SafeSeal tube 1.5 mL | Sarstedt | 72,706 | general use |
| Multiply-Pro cup 0.2 mL, PP | Sarstedt | 72,737,002 | general use |
| Centrifuge | equipment | ||
| PCR machine | equipment | ||
| Bioanalyzer | Agilent Technologies | equipment |
Riferimenti
- Swerdlow, S. H., et al. . WHO classification of tumors of haematopoietic and lymphoid tissues. 2, (2017).
- Baliakas, P., Mattsson, M., Stamatopoulos, K., Rosenquist, R. Prognostic indices in chronic lymphocytic leukaemia: where do we stand how do we proceed?. Journal of Internal Medicine. 279 (4), 347-357 (2016).
- Sutton, L. A., Rosenquist, R. The complex interplay between cell-intrinsic and cell-extrinsic factors driving the evolution of chronic lymphocytic leukemia. Seminars in Cancer Biology. , (2015).
- Mina, A., et al. Using prognostic models in CLL to personalize approach to clinical care: Are we there yet?. Blood Reviews. , (2017).
- Sutton, L. A., et al. Immunoglobulin genes in chronic lymphocytic leukemia: Key to understanding the disease and improving risk stratification. Haematologica. 102 (6), 968-971 (2017).
- Damle, R. N., et al. Ig V gene mutation status and CD38 expression as novel prognostic indicators in chronic lymphocytic leukemia. Blood. 94 (6), 1840-1847 (1999).
- Hamblin, T. J., Davis, Z., Gardiner, A., Oscier, D. G., Stevenson, F. K. Unmutated Ig V(H) genes are associated with a more aggressive form of chronic lymphocytic leukemia. Blood. 94 (6), 1848-1854 (1999).
- Burger, J. A., Chiorazzi, N. B cell receptor signaling in chronic lymphocytic leukemia. Trends in Immunology. 34 (12), 592-601 (2013).
- Packham, G., et al. The outcome of B-cell receptor signaling in chronic lymphocytic leukemia: proliferation or anergy. Haematologica. 99 (7), 1138-1148 (2014).
- Messmer, B. T., et al. Multiple distinct sets of stereotyped antigen receptors indicate a role for antigen in promoting chronic lymphocytic leukemia. The Journal of Experimental Medicine. 200 (4), 519-525 (2004).
- Stamatopoulos, K., et al. Over 20% of patients with chronic lymphocytic leukemia carry stereotyped receptors: Pathogenetic implications and clinical correlations. Blood. 109 (1), 259-270 (2007).
- Agathangelidis, A., et al. Stereotyped B-cell receptors in one-third of chronic lymphocytic leukemia: a molecular classification with implications for targeted therapies. Blood. 119 (19), 4467-4475 (2012).
- Stamatopoulos, K., Agathangelidis, A., Rosenquist, R., Ghia, P. Antigen receptor stereotypy in chronic lymphocytic leukemia. Leukemia. 31 (2), 282-291 (2017).
- Baliakas, P., et al. Clinical effect of stereotyped B-cell receptor immunoglobulins in chronic lymphocytic leukaemia: A retrospective multicentre study. The Lancet Haematology. 1 (2), 74-84 (2014).
- Gounari, M., et al. Excessive antigen reactivity may underlie, the clinical aggressiveness of chronic lymphocytic leukemia stereotyped subset #8. Blood. 125 (23), 3580-3587 (2015).
- Ntoufa, S., et al. B cell anergy modulated by TLR1/2 and the miR-17 approximately 92 cluster underlies the indolent clinical course of chronic lymphocytic leukemia stereotyped subset #4. Journal of Immunology. 196 (10), 4410-4417 (2016).
- Mansouri, L., et al. Functional loss of IkappaBepsilon leads to NF-kappaB deregulation in aggressive chronic lymphocytic leukemia. The Journal of Experimental Medicine. 212 (6), 833-843 (2015).
- Navrkalova, V., et al. ATM mutations in major stereotyped subsets of chronic lymphocytic leukemia: enrichment in subset #2 is associated with markedly short telomeres. Haematologica. 101 (9), e369-e373 (2016).
- Rossi, D., et al. Association between molecular lesions and specific B-cell receptor subsets in chronic lymphocytic leukemia. Blood. 121 (24), 4902-4905 (2013).
- Sutton, L. A., et al. Different spectra of recurrent gene mutations in subsets of chronic lymphocytic leukemia harboring stereotyped B-cell receptors. Haematologica. 101 (8), 959-967 (2016).
- Fischer, K., et al. Long-term remissions after FCR chemoimmunotherapy in previously untreated patients with CLL: Updated results of the CLL8 trial. Blood. 127 (2), 208-215 (2016).
- Rossi, D., et al. Molecular prediction of durable remission after first-line fludarabine-cyclophosphamide-rituximab in chronic lymphocytic leukemia. Blood. 126 (16), 1921-1924 (2015).
- Thompson, P. A., et al. Fludarabine, cyclophosphamide, and rituximab treatment achieves long-term disease-free survival in IGHV-mutated chronic lymphocytic leukemia. Blood. 127 (3), 303-309 (2016).
- Hallek, M., et al. Guidelines for diagnosis, indications for treatment, response assessment and supportive management of chronic lymphocytic leukemia. Blood. , (2018).
- van Dongen, J. J., et al. Design and standardization of PCR primers and protocols for detection of clonal immunoglobulin and T-cell receptor gene recombinations in suspect lymphoproliferations: report of the BIOMED-2 Concerted Action BMH4-CT98-3936. Leukemia. 17 (12), 2257-2317 (2003).
- Campbell, M. J., Zelenetz, A. D., Levy, S., Levy, R. Use of family specific leader region primers for PCR amplification of the human heavy chain variable region gene repertoire. Molecular Immunology. 29 (2), 193-203 (1992).
- Rosenquist, R., et al. Immunoglobulin gene sequence analysis in chronic lymphocytic leukemia: updated ERIC recommendations. Leukemia. 31 (7), 1477-1481 (2017).
- Linke, B., et al. Automated high resolution PCR fragment analysis for identification of clonally rearranged immunoglobulin heavy chain genes. Leukemia. 11 (7), 1055-1062 (1997).
- Gonzalez, M., et al. Heteroduplex analysis of VDJ amplified segments from rearranged IgH genes for clonality assessments in B-cell non-Hodgkin’s lymphoma. A comparison between different strategies. Haematologica. 84 (9), 779-784 (1999).
- Brochet, X., Lefranc, M. P., Giudicelli, V. IMGT/V-QUEST: The highly customized and integrated system for IG and TR standardized V-J and V-D-J sequence analysis. Nucleic Acids Research. 36 (Web Server issue), W503-W508 (2008).
- Yousfi Monod, M., Giudicelli, V., Chaume, D., Lefranc, M. P. IMGT/JunctionAnalysis: The first tool for the analysis of the immunoglobulin and T cell receptor complex V-J and V-D-J JUNCTIONs. Bioinformatics. 20, i379-i385 (2004).
- Bystry, V., et al. ARResT/AssignSubsets: A novel application for robust subclassification of chronic lymphocytic leukemia based on B cell receptor IG stereotypy. Bioinformatics. 31 (23), 3844-3846 (2015).
- Belessi, C. J., et al. IGHV gene insertions and deletions in chronic lymphocytic leukemia: "CLL-biased" deletions in a subset of cases with stereotyped receptors. European Journal of Immunology. 36 (7), 1963-1974 (2006).
- Langerak, A. W., et al. Immunoglobulin sequence analysis and prognostication in CLL: guidelines from the ERIC review board for reliable interpretation of problematic cases. Leukemia. 25 (6), 979-984 (2011).
- Heyman, B., Volkheimer, A. D., Weinberg, J. B. Double IGHV DNA gene rearrangements in CLL: Influence of mixed-mutated and -unmutated rearrangements on outcomes in CLL. Blood Cancer Journal. 6 (7), e440 (2016).
- Farooqui, M. Z., et al. Ibrutinib for previously untreated and relapsed or refractory chronic lymphocytic leukaemia with TP53 aberrations: A phase 2, single-arm trial. The Lancet Oncology. 16 (2), 169-176 (2015).
- Furman, R. R., et al. Idelalisib and rituximab in relapsed chronic lymphocytic leukemia. The New England Journal of Medicine. 370 (11), 997-1007 (2014).
- Burger, J. A., et al. Ibrutinib as initial therapy for patients with chronic lymphocytic leukemia. The New England Journal of Medicine. 373 (25), 2425-2437 (2015).
Citazione di questo articolo
Agathangelidis, A., Sutton, L. A., Hadzidimitriou, A., Tresoldi, C., Langerak, A. W., Belessi, C., Davi, F., Rosenquist, R., Stamatopoulos, K., Ghia, P. Immunoglobulin Gene Sequence Analysis In Chronic Lymphocytic Leukemia: From Patient Material To Sequence Interpretation. J. Vis. Exp. (141), e57787, doi:10.3791/57787 (2018).