Трассировка экспрессии генов путем обнаружения активности β-галактозидазы в целом мыши эмбрионов
Summary
Здесь мы опишем стандартный протокол для выявления активности β-галактозидазы в начале всего мыши эмбрионов и метод для парафина секционирование и counterstaining. Это простая и быстрая процедура для мониторинга экспрессии генов в процессе разработки, которые могут также применяться для разделов ткани, органов или культивируемых клеток.
Abstract
Кишечная палочка LacZ гену, β-галактозидазы, в основном используется как репортер экспрессии генов и как трассировщик клеток линии исследований. Классическая гистохимические реакция основана на гидролиз субстрата X-гал в сочетании с ионами железа и черных, который производит нерастворимых синий осадок, который легко визуализировать. Таким образом активность β-галактозидазы выступает в качестве маркера для выражения гена интереса по мере развития. Здесь мы опишем стандартный протокол для выявления активности β-галактозидазы в начале всего мыши эмбрионов и последующий метод для парафина секционирование и counterstaining. Кроме того процедура для уточнения весь эмбрионов предоставляется лучше визуализировать X-Гал пятнать в более глубоких зонах эмбриона. Согласованные результаты получаются путем выполнения этой процедуры, хотя оптимизация условий реакции необходима для сведения к минимуму фоновой активности. Ограничения в assay должны рассматриваться также, особенно в отношении размера эмбриона окрашивания всю гору. Наш протокол обеспечивает чувствительной и надежный метод для обнаружения β-галактозидазы в процессе разработки мыши, который может применяться в криостата секций, а также целые органы. Таким образом динамический ген выражение шаблоны разработки может быть легко проанализирован с помощью этого протокола в целом эмбрионов, но также подробные выражение на клеточном уровне может оцениваться после разрезания парафин.
Introduction
Для того чтобы описать картин выражения определенного гена, использование репортер генов как маркеры был исключительно от дрозофилы до млекопитающих. В экспериментах с участием нокаут и трансгенных животных гена бактериальной β-галактозидазы (LacZ) Escherichia coli (E. coli) является одним из наиболее широко используемых в1,2,3, 4. β-галактозидазы (β-gal) катализирует гидролиз β-galactosides (например, лактоза) в моносахариды (глюкозы и галактозы)5. Его наиболее часто используемые субстрата является X-Гал (5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside), гликозид, гидролизуется по β-галактозидазы приведшего к 5-бромо-4-хлоро-3-гидроксииндол и галактозы. Первый окисляется в димер, когда используется в сочетании с Ферри калия- и Ферро цианид, производит характерный нерастворимые, синий цвет осадок (рис. 1)6.
Ген LacZ начал использоваться как репортер ген более тридцати лет назад7,8. Обычно, вставляется LacZ вниз по течению от эндогенных промоутер месте открытой чтении кадра, поэтому она может использоваться в культуре бактерий и клеток для визуализации ячеек, содержащих определенного Вставка, а также в трансгенных животных как трассировщик эндогенных картин выражения гена во время развития9. В этой связи визуализация активности β-галактозидазы широко применяется в дрозофилы для понимания развития и клеточных процессов от единичных клеток во всей ткани. Генетики дрозофилы пользу поколение стабильной линий, в которых изменение P-элемент конструкции, содержащие Репортер ген LacZ , вставляется наугад мест в геноме. Таким образом когда под влиянием усилитель элементы он может диск свое выражение определенным образом ткани, которая позволила систематический анализ структуры выражения многих генов в течение последних двух десятилетий10. Кроме того использование трансгенных мышей для мониторинга LacZ экспрессии генов также позволяет обнаружение событий рекомбинации генов, КРР loxP при посредничестве рекомбинации и локализации производных мутант эмбриональных стволовых клеток в химерных анализа 11, которая облегчает контроль LacZ выражения в определенных тканях также как височно. Кроме того в целом эмбрионов, обнаружение активности β-галактозидазы может производить дифференцированного окрашивания моделей на различной интенсивности, которые можно удобно наблюдать через различные этапы развития проанализировать временные изменения в экспрессии генов 8,12.
В этой статье мы представляем протокол для визуализации экспрессии генов через X-Гал пятнать в целом гора ткани на ранних этапах своего развития зародышей мыши. Мы представляем этот гистохимический метод как весьма деликатного и недорогой техники, которая выступает точное обнаружение помеченных клеток в целом гора образцов или на клеточном уровне, после того, как парафин-врезанных тканей или эмбрионов. Метод позволяет для прямого визуализации окрашивание ткани мыши с минимальное образование по сравнению с другими методами13.
Protocol
Representative Results
Discussion
E. coli ген LacZ широко используется как репортер в исследованиях картин выражения гена из-за его высокой чувствительностью и легкости обнаружения. Настоящий Протокол описывает классический метод для обнаружения β-Гал выражение на основе ферментативные реакции, которая легко и быстр?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы хотели бы поблагодарить службу гистопатологические их технической помощи в Centro Nacional de Investigaciones Cardiovasculares (CNIC). Мы также благодарим д-р Motoharu Seiki для любезно предоставление Mt4-ММЗLacZ мышей и д-р Алисия G. Арройо, для поддержки нашего проекта и для ее критического чтения рукописи. Мы хотим поблагодарить Питера Бонни для корректуры этой статьи. Эта работа была поддержана Europea Мадридский посредством гранта (# 2017UEM01) в ЦСК
Materials
| REAGENTS | |||
| 2-Propanol | SIGMA-ALDRICH | 24137-1L-R | |
| Agarose | SCHARLAU | 50004/ LE3Q2014 | |
| Aqueous mounting medium | VECTOR LABS | H-5501 | |
| Synthetic mounting media | MERCK | 100579 | |
| 96% Ethanol | PROLABO | 20824365 | |
| 99.9% Ethanol absolute | SCHARLAU | ET00021000 | |
| 50% Glutaraldehyde solution | SIGMA-ALDRICH | G6403-100ml | |
| 85% Glycerol | MERCK | 104094 | |
| 99.9% Glycerol | SIGMA-ALDRICH | G5516 | |
| Magnesium chloride hexahydrate | SIGMA-ALDRICH | 63064 | |
| Nonionic surfactant (Nonidet P-40) | SIGMA-ALDRICH | 542334 | |
| Nuclear Fast Red counterstain | SIGMA-ALDRICH | N3020 | |
| Paraffin pastilles | MERCK | 111609 | |
| Paraformaldehyde | SIGMA-ALDRICH | 158127-500g | |
| Phosphate buffered saline (tablets) | SIGMA-ALDRICH | P4417-50TAB | |
| Potassium ferrocyanate | MERCK | 1049840500 | |
| Potassium ferrocyanide | MERCK | 1049731000 | |
| Sodium azide | SIGMA-ALDRICH | S8032 | |
| Sodium deoxycholate | SIGMA-ALDRICH | 30970 | |
| Sodium dihydrogen phosphate monohydrate | SIGMA-ALDRICH | 106346 | |
| Sodium phosphate dibasic dihydrate | SIGMA-ALDRICH | 71638 | |
| Thymol | SIGMA-ALDRICH | T0501 | |
| Tris hydrochloride (Tris HCl) | SIGMA-ALDRICH | 10812846001 (Roche) | |
| X-GAL | VENN NOVA | R-0004-1000 | |
| Xylene | VWR CHEMICALS | VWRC28973.363 | |
| EQUIPMENT | |||
| Disposable plastic cryomolds 15x15x5 mm | SAKURA | 4566 | |
| Rotatory Microtome | Leica | RM2235 | |
| Cassettes | Oxford Trade | OT-10-9046 | |
| Microscope Cover Glasses 24×60 mm | VWR | ECN631-1575 | |
| Microscope slides | Thermo Scientific, MENZEL-GLÄSER | AGAA000001#12E | |
| Adhesion microscope slides | Thermo Scientific, MENZEL-GLÄSER | J1820AMNZ | |
| Flotation Water bath | Leica | HI1210 | |
| Disposable Low Profile Microtome Blades | Feather | UDM-R35 | |
| Paraffin oven | J.R. SELECTA | 2000205 | |
| Wax Paraffin dispenser | J.R. SELECTA | 4000490 | |
| Stereomicroscope | Leica | DM500 | |
| Polypropylene microcentrifuge tubes 2.0 mL | SIGMA-ALDRICH | T2795 | |
| Polypropylene microcentrifuge tubes 1.5 mL | SIGMA-ALDRICH | T9661 | |
| Orbital shaker | IKA Labortechnik | HS250 BASIC | |
| Stirring Hot Plate | Bibby | HB502 | |
| Vortex Shaker | IKA Labortechnik | MS1 | |
| Laboratory scale | GRAM | FH-2000 | |
| Precision scale | Sartorius | ISO9001 | |
| pHmeter | Crison | Basic 20 | |
| Optic fiber | Optech | PL2000 |
Riferimenti
- Shuman, H. A., Silhavy, T. J., Beckwith, J. R. Labeling of proteins with beta-galactosidase by gene fusion. Identification of a cytoplasmic membrane component of the Escherichia coli maltose transport system. The Journal of Biological Chemistry. 255, 168-174 (1980).
- Cui, C., Wani, M. A., Wight, D., Kopchick, J., Stambrook, P. J. Reporter genes in transgenic mice. Transgenic Research. 3, 182 (1994).
- Takahashi, E., et al. Expression analysis of Escherichia coli lacZ reporter gene in transgenic mice. Brain Research. Brain Research Protocols. 5 (2), 159-166 (2000).
- Burn, S. F. Detection of β-Galactosidase Activity: X-gal Staining. Methods Mol Biol. 886, 241-250 (2012).
- Jacob, F., Monod, J. Genetic regulatory mechanisms in the synthesis of proteins. J Mol Biol. 3, 318-356 (1961).
- Pearson, B., Wolf, P. L., Vazquez, J. A comparative study of a series of new indolyl compounds to localize beta-galactosidase in tissues. Laboratory Investigation; a Journal of Technical Methods and Pathology. 12, 1249-1259 (1963).
- Kothary, R., et al. A transgene containing lacZ inserted into the dystonia locus is expressed in neural tube. Nature. 335 (6189), 435-437 (1988).
- Kothary, R., et al. Inducible expression of an hsp68-lacZ hybrid gene in transgenic mice. Development. 105 (4), 707-714 (1989).
- Blanco, M. J., et al. Developmental expression of membrane type 4-matrix metalloproteinase (Mt4-mmp/Mmp17) in the mouse embryo. PLOS ONE. 12 (9), e0184767 (2017).
- Hartenstein, V., Jan, Y. N. Studying Drosophila embryogenesis with P-lacZ enhancer trap lines. Roux’s Archives of Developmental Biology. 201 (4), 194-220 (1992).
- Gierut, J. J., Jacks, T. E., Haigis, K. M. Whole-mount X-Gal staining of mouse tissues. Cold Spring Harb Protoc. 1 (4), 417-419 (2014).
- Cooper, M. A., Zhou, R. β-Galactosidase Staining of LacZ Fusion Proteins in Whole Tissue Preparations. Methods Mol Biol. 1018, 189-197 (2013).
- Sundararajan, S., Wakamiya, M., Behringer, R. R., Rivera-Pérez, J. A. A fast and sensitive alternative for β-galactosidase detection in mouse embryos. Development. 139 (23), 4484-4490 (2012).
- Wei, Q., Manley, N. R., Condie, B. G. Whole mount in situ hybridization of E8.5 to E11.5 mouse embryos. Journal of Visualized Experiments. 56, 2797 (2011).
- Rikimaru, A., et al. Establishment of an MT4-MMP-deficient mouse strain representing an efficient tracking system for MT4-MMP/MMP-17 expression in vivo using beta-galactosidase. Genes Cells. 12 (9), 1091-1100 (2007).
- Leight, J. L., Alge, D. L., Maier, A. J., Anseth, K. S. Direct measurement of matrix metalloproteinase activity in 3D cellular microenvironments using a fluorogenic peptide substrate. Biomaterials. 34 (30), 7344-7352 (2013).
- Ma, W., Rogers, K., Zbar, B., Schmidt, L. Effects of different fixatives on β-galactosidase activity. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 50 (10), 1421-1424 (2002).
- Lojda, Z. Indigogenic methods for glycosidases. II. An improved method for beta-D-galactosidase and its application to localization studies of the enzymes in the intestine and in other tissues. Histochemie. 23 (3), 266-288 (1970).
- Trifonov, S., Yamashita, Y., Kase, M., Maruyama, M., Sugimoto, T. Overview and assessment of the histochemical methods and reagents for the detection of β-galactosidase activity in transgenic animals. Anat Sci Int. 91, 56-67 (2016).
- Sanchez-Ramos, J., et al. The X-gal Caution in Neural Transplantation Studies. Cell Transplantation. 9 (5), 657-667 (2000).
- Weiss, D. J., Liggitt, D., Clark, J. G. In situ histochemical detection of beta-galactosidase activity in lung: assessment of X-Gal reagent in distinguishing lacZ gene expression and endogenous beta-galactosidase activity. Hum Gene Ther. 8 (13), 1545-1554 (1997).
- Merkwitz, C., Blaschuk, O., Schulz, A., Ricken, A. M. Comments on Methods to Suppress Endogenous β-Galactosidase Activity in Mouse Tissues Expressing the LacZ Reporter Gene. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 64 (10), 579-586 (2016).
- Buesa, R. J., Peshkov, M. V. Histology without xylene. Annals of Diagnostic Pathology. 13, 246-256 (2009).
- Richardson, D. S., Lichtman, J. W. Clarifying Tissue Clearing. Cell. 162 (2), 246-257 (2015).
- Kandyala, R., Raghavendra, S. P. C., Rajasekharan, S. T. Xylene: An overview of its health hazards and preventive measures. Journal of Oral and Maxillofacial Pathology. 14 (1), 1-5 (2010).
- Hinds, H. L. A Comparison of Three Xylene Substitutes. Laboratory Medicine. 17 (12), 752-755 (1986).
- Merkwitz, C., Blaschuk, O., Winkler, J., Schulz, A., Prömel, S., Ricken, A. M. Advantages and Limitations of Salmon-Gal/Tetrazolium Salt Histochemistry for the Detection of LacZ Reporter Gene Activity in Murine Epithelial Tissue. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 65 (4), 197-206 (2017).
- Levitsky, K. L., Toledo-Aral, J. J., López-Barneo, J., Villadiego, J. Direct confocal acquisition of fluorescence from X-gal staining on thick tissue sections. Scientific Reports. 3, 2937 (2013).
- Shen, X., Bao, W., Yu, W., Liang, R., Nguyen, B., Yu Liu, Y. An improved method with high sensitivity and low background in detecting low β-galactosidase expression in mouse embryos. PLoS One. 12 (5), (2017).
- Komatsu, Y., Kishigami, S., Mishina, Y. In situ Hybridization Methods for Mouse Whole Mounts and Tissue Sections with and Without Additional β-Galactosidase. Methods Mol Biol. 1092, 1-15 (2014).
- Jeong, Y., Epstein, D. J. Distinct regulators of Shh transcription in the floor plate and notochord indicate separate origins for these tissues in the mouse node. Development. 130 (16), 3891-3902 (2003).
- Eid, R., Koseki, H., Schughart, K. Analysis of LacZ reporter genes in transgenic embryos suggests the presence of several cis-acting regulatory elements in the murine Hoxb-6 gene. Developmental Dynamics. 196 (3), 205-216 (1993).
- Will, A. J., et al. Composition and dosage of a multipartite enhancer cluster control developmental expression of Ihh (Indian hedgehog). Nature Genetics. 49 (10), 1539-1545 (2017).
- Stanford, W. L., Cohn, J. B., Cordes, S. P. Gene-trap mutagenesis: past, present and beyond. Nature Reviews Genetics. 2 (10), 756-768 (2001).
- Ménoret, S., et al. lacZ transgenic rats tolerant for beta-galactosidase: recipients for gene transfer studies using lacZ as a reporter gene. Human Gene Therapy. 13 (11), 1383-1390 (2002).
- Takahashi, M., et al. Establishment of lacZ-transgenic rats: a tool for regenerative research in myocardium. Biochemical and Biophysical Research Communications. 305 (4), 904-908 (2003).
- Mozdziak, P. E., Borwornpinyo, S., McCoy, D. W., Petitte, J. N. Development of transgenic chickens expressing bacterial betagalactosidase. Developmental Dynamics. 226 (3), 439-445 (2003).
- Mozdziak, P. E., Wu, Q., Bradford, J. M., Pardue, S. L., Borwornpinyo, S., Giamario, C., Petitte, J. N. Identification of the lacZ insertion site and beta-galactosidase expression in transgenic chickens. Cell Tissue Research. 324 (1), 41-53 (2006).
- Hartley, K. O., Nutt, S. L., Amaya, E. Targeted gene expression in transgenic Xenopus using the binary Gal4-UAS system. Proceedings of the National Academy of Science U.S.A. 99, 1377-1382 (2002).
- Scheer, N., Campos-Ortega, J. A. Use of the Gal4-UAS technique for targeted gene expression in the zebrafish. Mechanisms of Development. 80 (2), 153-158 (1999).
- Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118 (2), 401-415 (1993).
- Lee, B. Y., et al. Senescence-associated beta-galactosidase is lysosomal beta-galactosidase. Aging Cell. 5 (2), 187-195 (2006).
- Morais, K. S., Guimarães, A. F. R., Ramos, D. A. R., Silva, F. P., de Oliveira, D. M. Long-term exposure to MST-312 leads to telomerase reverse transcriptase overexpression in MCF-7 breast cancer cells. Anti-Cancer Drugs. 28 (7), 750-756 (2017).
- Dimri, G. P., et al. A biomarker that identifies senescent human cells in culture and in aging skin in vivo. Proceedings of the National Academy of Science U.S.A. 92 (20), 9363-9367 (1995).
