L'analisi di espressione genica tramite rilevazione di attività di β-galattosidasi in embrioni di topo intero
Summary
Qui descriviamo il protocollo standard per la rilevazione di attività di β-galattosidasi in primi embrioni di topo intero e il metodo per paraffina sezionamento e colorazione di contrasto. Si tratta di una procedura facile e veloce per monitorare l’espressione genica durante lo sviluppo che può essere applicato anche a sezioni di tessuto, organi o cellule coltivate.
Abstract
L’Escherichia coli LacZ gene che codifica per β-galattosidasi, è in gran parte utilizzato come reporter per l’espressione genica e come tracciante negli studi di lignaggio cellulare. La classica reazione istochimica si basa sull’idrolisi del substrato X-gal in combinazione con gli ioni ferrici e ferrosi, che produce un precipitato insolubile blu che è facile da visualizzare. Di conseguenza, attività della β-galattosidasi serve come indicatore per il modello di espressione del gene di interesse lo sviluppo procede. Qui descriviamo il protocollo standard per la rilevazione di attività di β-galattosidasi in primi embrioni di topo intero e il conseguente metodo per paraffina sezionamento e colorazione di contrasto. Inoltre, è disponibile una procedura per chiarire interi embrioni per visualizzare meglio il X-gal macchiatura in regioni più profonde dell’embrione. Risultati costanti ottenuti eseguendo questa procedura, anche se l’ottimizzazione delle condizioni di reazione è necessaria per ridurre l’attività di sfondo. Limitazioni nel dosaggio dovrebbero essere considerati anche, specialmente per quanto riguarda le dimensioni dell’embrione intero supporto della colorazione. Il nostro protocollo prevede un sensibile e un metodo affidabile per la rilevazione di β-galattosidasi durante lo sviluppo del mouse che possa essere applicato alle sezioni al criostato, nonché di organi interi. Così, la dinamica espressione genica durante lo sviluppo possa essere facilmente analizzati utilizzando questo protocollo in interi embrioni, ma anche espressione dettagliata a livello cellulare può essere valutato dopo il sezionamento della paraffina.
Introduction
Al fine di descrivere il pattern di espressione genica specifici, l’uso di geni reporter come marcatori è stato fondamentale dalla drosofila ai mammiferi. Negli esperimenti che coinvolgono gli animali transgenici e knockoui, il gene batterico β-galattosidasi (LacZ) di Escherichia coli (Escherichia coli) è uno dei più ampiamente usato1,2,3, 4. β-galattosidasi (β-gallone) catalizza l’idrolisi di β-galactosides (come il lattosio) in monosaccaridi (glucosio e galattosio)5. Il substrato più comunemente usato è il X-gal (5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside), un glicoside che viene idrolizzato dalla β-galattosidasi, generando 5-bromo-4-chloro-3-hydroxyindole e galattosio. Il primo è ossidato in un dimero che, quando utilizzato combinato con potassio ferri- e ferro-cianuro, produce un caratteristico insolubile, colore blu precipitare (Figura 1)6.
Il gene LacZ iniziò ad essere usato come un gene reporter più di trenta anni fa7,8. Solitamente, LacZ viene inserito a valle di un promotore endogeno nel luogo l’open reading frame, quindi può essere utilizzato nella cultura batterica e cella per visualizzare le celle che contengono un inserto particolare, così come negli animali transgenici come tracciante di endogeno pattern di espressione genica durante lo sviluppo9. A questo proposito, la visualizzazione dell’attività della β-galattosidasi è stato ampiamente utilizzata in drosofila per comprendere i processi cellulari e dello sviluppo da singole cellule ai tessuti tutta. Genetica della drosofila favorisce la generazione di linee stabili in cui un costrutto di P-elemento modificato contenente il gene reporter che lacZ è inserito in modo casuale posizioni nel genoma. Così, quando posto sotto l’influenza degli elementi enhancer può guidare l’espressione in modo specifico del tessuto, che ha permesso l’analisi sistematica dei modelli di espressione di molti geni negli ultimi due decenni10. Inoltre, l’uso di topi transgenici per monitorare l’espressione del gene LacZ consente inoltre di rilevazione degli eventi di ricombinazione genica di Cre-loxP mediata ricombinazione e la localizzazione dei derivati mutante cellule embrionali staminali in analisi chimerici 11, che facilita il controllo di LacZ espressione in tessuti specifici come pure temporaneamente. Inoltre, in interi embrioni, rilevamento dell’attività β-galattosidasi può produrre pattern di colorazione differenziale alle diverse intensità che si possono comodamente osservare attraverso diversi stadi di sviluppo per analizzare i cambiamenti temporali nell’espressione del gene 8,12.
In questo articolo, presentiamo un protocollo per visualizzare l’espressione genica attraverso il X-gal macchiatura nel tessuto intero supporto nelle fasi iniziali dello sviluppo degli embrioni del mouse. Vi presentiamo questo metodo istochimico come una tecnica altamente sensibile e poco costoso che favorisce un rilevamento accurato delle cellule con etichettate intero supporto esemplari o al livello cellulare dopo paraffina embedded tessuti o embrioni. Il metodo consente la visualizzazione diretta di macchiatura nel tessuto del mouse con lo sfondo minimo se confrontato con altri metodi13.
Protocol
Representative Results
Discussion
Il gene LacZ di e. coli è stato ampiamente usato come un reporter in studi di espressione genica a causa della sua alta sensibilità e la facilità di rilevazione. Il presente protocollo descrive un metodo classico per la rilevazione di β-gallone espressione basata su una reazione enzimatica che è facile e veloce da eseguire e poco costoso. Questo metodo può essere applicato anche senza grosse modifiche nell’intero supporto embrioni, organi intatti, sezioni di tessuto criostato o cellule coltivate.
<p cl…Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vorremmo ringraziare il servizio istopatologico per la loro assistenza tecnica presso il Centro Nacional de Investigaciones Cardiovasculares (CNIC). Ringraziamo anche Dr. Motoharu Seiki per gentilmente fornendo Mt4-mmpLacZ topi e Dr. Alicia G. Arroyo per sostenere il nostro progetto e per la sua lettura critica del manoscritto. Desideriamo ringraziare Peter Bonney per la correzione di questo articolo. Questo lavoro è stato supportato da Universidad Europea de Madrid tramite una sovvenzione (# 2017UEM01) assegnata al c.s.c.
Materials
| REAGENTS | |||
| 2-Propanol | SIGMA-ALDRICH | 24137-1L-R | |
| Agarose | SCHARLAU | 50004/ LE3Q2014 | |
| Aqueous mounting medium | VECTOR LABS | H-5501 | |
| Synthetic mounting media | MERCK | 100579 | |
| 96% Ethanol | PROLABO | 20824365 | |
| 99.9% Ethanol absolute | SCHARLAU | ET00021000 | |
| 50% Glutaraldehyde solution | SIGMA-ALDRICH | G6403-100ml | |
| 85% Glycerol | MERCK | 104094 | |
| 99.9% Glycerol | SIGMA-ALDRICH | G5516 | |
| Magnesium chloride hexahydrate | SIGMA-ALDRICH | 63064 | |
| Nonionic surfactant (Nonidet P-40) | SIGMA-ALDRICH | 542334 | |
| Nuclear Fast Red counterstain | SIGMA-ALDRICH | N3020 | |
| Paraffin pastilles | MERCK | 111609 | |
| Paraformaldehyde | SIGMA-ALDRICH | 158127-500g | |
| Phosphate buffered saline (tablets) | SIGMA-ALDRICH | P4417-50TAB | |
| Potassium ferrocyanate | MERCK | 1049840500 | |
| Potassium ferrocyanide | MERCK | 1049731000 | |
| Sodium azide | SIGMA-ALDRICH | S8032 | |
| Sodium deoxycholate | SIGMA-ALDRICH | 30970 | |
| Sodium dihydrogen phosphate monohydrate | SIGMA-ALDRICH | 106346 | |
| Sodium phosphate dibasic dihydrate | SIGMA-ALDRICH | 71638 | |
| Thymol | SIGMA-ALDRICH | T0501 | |
| Tris hydrochloride (Tris HCl) | SIGMA-ALDRICH | 10812846001 (Roche) | |
| X-GAL | VENN NOVA | R-0004-1000 | |
| Xylene | VWR CHEMICALS | VWRC28973.363 | |
| EQUIPMENT | |||
| Disposable plastic cryomolds 15x15x5 mm | SAKURA | 4566 | |
| Rotatory Microtome | Leica | RM2235 | |
| Cassettes | Oxford Trade | OT-10-9046 | |
| Microscope Cover Glasses 24×60 mm | VWR | ECN631-1575 | |
| Microscope slides | Thermo Scientific, MENZEL-GLÄSER | AGAA000001#12E | |
| Adhesion microscope slides | Thermo Scientific, MENZEL-GLÄSER | J1820AMNZ | |
| Flotation Water bath | Leica | HI1210 | |
| Disposable Low Profile Microtome Blades | Feather | UDM-R35 | |
| Paraffin oven | J.R. SELECTA | 2000205 | |
| Wax Paraffin dispenser | J.R. SELECTA | 4000490 | |
| Stereomicroscope | Leica | DM500 | |
| Polypropylene microcentrifuge tubes 2.0 mL | SIGMA-ALDRICH | T2795 | |
| Polypropylene microcentrifuge tubes 1.5 mL | SIGMA-ALDRICH | T9661 | |
| Orbital shaker | IKA Labortechnik | HS250 BASIC | |
| Stirring Hot Plate | Bibby | HB502 | |
| Vortex Shaker | IKA Labortechnik | MS1 | |
| Laboratory scale | GRAM | FH-2000 | |
| Precision scale | Sartorius | ISO9001 | |
| pHmeter | Crison | Basic 20 | |
| Optic fiber | Optech | PL2000 |
Riferimenti
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