Sola célula cuantificación del mRNA y la expresión de la proteína de superficie de CD4 infectados por el Virus de la inmunodeficiencia de los simios⁺ T las células aisladas de macaques del macaco de la India

Muchos patógenos intracelulares dependen de maquinaria de la célula huésped para replicar, a menudo alterando la biología de la célula huésped o dirigidas a subpoblaciones muy específicas de las células del huésped para maximizar sus posibilidades de propagación. Como resultado, los procesos biológicos celulares comúnmente se interrumpen, con consecuencias deletéreas para la salud general del hospedero. Comprensión de las interacciones entre el virus y las células hospedadoras que replican a aclarar mecanismos de la enfermedad que pueden ayudar en el desarrollo de mejores terapias y estrategias para prevenir la infección. Directas herramientas analíticas que permiten el estudio de las interacciones huésped-patógeno son esenciales para este fin. Sola célula análisis proporciona el único medio para atribuir inequívocamente un fenotipo celular a un genotipo particular o infección estado¹. Por ejemplo, infecciones patógenas frecuentemente inducen cambios directos e indirectos en las células del huésped. Por lo tanto, distinguir las células infectadas de sus contrapartes no infectadas es necesario cambios de atributo anfitrión célula infección directa o efectos secundarios, tales como generalizada inflamación. Por otra parte, para muchos patógenos, como el SIV y el virus de inmunodeficiencia humana (VIH), infección de la célula huésped procede a través de etapas múltiples, tales como temprano, tarde, o latente, que puede caracterizarse por genes distintos y de perfiles de expresión de la proteína^{2 , 3 , 4 , 5}. Análisis de bulk de mezclas celular dejará de capturar esta heterogeneidad⁶. Por el contrario, altamente multiplexadas en análisis unicelulares capaces de cuantificar la expresión de ambos virus y genes de host ofrecen un medio para resolver las perturbaciones celulares específicos de infección, incluyendo las variaciones en distintas etapas de la infección. Además, análisis huésped-patógeno en fisiológicamente ajustes pertinentes es fundamental para la identificación de eventos que se producen en los organismos infectados. Así, los procesos de métodos que pueden aplicarse directamente ex vivo son probablemente mejor captura en vivo .

SIV y VIH objetivo CD4⁺ T las células, en el cual ellos contrarrestar factores antivirales “restricción” de host y downregulate antígeno que presenta las moléculas para establecer infección productiva y evitar la vigilancia inmune^{7,8, 9,10,11}. Sin tratamiento, la infección resulta en la pérdida masiva de CD4⁺ T de las células, en última instancia culminando en adquirido de la inmunodeficiencia adquirida (SIDA)¹². En el marco de la terapia antiretroviral, célula latente infectada depósitos persisten durante décadas, planteando una barrera formidable a estrategias curativas. Comprender las propiedades de en vivo células infectadas por el VIH/SIV tiene el potencial para revelar características de la célula de host en la patogenia y persistencia. Sin embargo, esto ha sido muy difícil, debido principalmente a la obviados de las células infectadas y la falta de reactivos capaces de identificarlos fácilmente. Las células que transcriben el ARN viral, se estima que en 0.01 – 1% de CD4⁺ T las células en la sangre y tejido linfoide^13,14,15. Bajo tratamiento supresivo, células latente infectadas son aún menos frecuentes en 10^-3-10^{-7 16,17,18}. La coloración de la proteína viral ensayos que trabajo bien para el estudio de las infecciones in vitro , tales como Gag intracelular, son subóptimos debido a la tinción de fondo de 0.01 – 0.1%, similar o mayor que la frecuencia de las células infectadas^{13, 14}. Coloración superficial para proteína Env bien caracterizados anticuerpos monoclonales SIV y VIH Env-específicas también ha demostrado ser difícil, probablemente por razones similares. Recientemente, nuevas herramientas tienen por objeto mejorar la detección de las células que expresan la mordaza ya sea por la incorporación de ensayos específicos para gag RNA o usando proyección de imagen alternativas tecnologías^14,15,19. Sin embargo, estos enfoques siguen siendo limitados en el número de mediciones cuantitativas realizadas en cada célula.

Aquí, describimos la metodología que (1) identifica las células virus-infectadas directamente ex vivo por gene viral sensible y específico cuantitativo qPCR y (2) cuantifica la expresión de proteínas de la superficie hasta 18 y 96 genes por cada infectado (y célula no infectada). Esta metodología combina la medición de la proteína unicelular de la superficie por FACS seguido de lisis celular inmediata y análisis de expresión génica usando multiplexado qPCR específica en el sistema de Biomark. La tecnología integrado circuito fluídico (IFC) permite cuantificación multiplexada de 96 genes de 96 muestras al mismo tiempo, logrado por una matriz de 9.216 cámaras en las que se realizan las reacciones individuales de la qPCR. La clasificación de células vivas FACS registra las mediciones de abundancia de proteína de alto contenido mientras que preserva el transcriptoma completo para análisis realizados inmediatamente aguas abajo. Para identificar las células virus-infectadas, ensayos específicos para RNAs virales o bien empalmados y unspliced (vRNA) están incluidos en el análisis de qPCR, junto a un panel de análisis definidos por el usuario por un total de hasta 96 genes, el número máximo de ensayos actualmente alojados en la IFC. La expresión de genes y proteína información recogido para cada celda están vinculados por la posición bien. Divulgamos previamente los resultados de este análisis en otro lugar²⁰. Presentamos más detallada lineamientos metodológicos así como más descriptivo phenotyping de CD4 infectados por SIV⁺ T las células.

Este enfoque, que llamamos tSCEPTRE, puede aplicarse a las suspensiones de cualquier población de células viables reactiva a anticuerpos fluorescente etiquetados y expresando un transcriptoma compatible con ensayos de qPCR disponibles. Por ejemplo, puede utilizarse para la caracterización génica diferencial y expresión de proteínas en las células raras o no fácilmente distinguidas por marcadores de la proteína de la superficie de las células. La preparación de la muestra se basa en un estándar de protocolo utilizando anticuerpos comercialmente disponibles de tinción. Citómetros con capacidad clasificación unicelulares están también disponibles comercialmente, pero medidas de bioseguridad adicionales son necesarios para el procesamiento de células vivas infecciosas. Registrar el perfil de expresión – una proteína de la célula para cada celda por bien puesto, contemplado en el presente como indexadas clasificación, es una característica común de FACS comercialmente disponible software de clasificación. Análisis computacional de genes diferencialmente expresados host entre poblaciones celulares de interés no se describen aquí, pero se proporcionan referencias a los métodos previamente publicados.