Cella singola quantificazione del mRNA e l'espressione di proteine di superficie CD4 infettati da Virus di immunodeficienza delle scimmie⁺ T cellule isolate da macachi Rhesus

Molti agenti patogeni intracellulari si basano su macchina cellula ospite per replicare, spesso targeting molto specifiche sottopopolazioni di cellule dell’ospite per massimizzare le loro possibilità di propagazione o alterare la biologia delle cellule ospite. Di conseguenza, i processi biologici delle cellule sono comunemente perturbati, con conseguenze deleterie per la salute generale dell’ospite. Comprensione delle interazioni tra virus e cellule dell’ospite in cui si replicano chiariranno i meccanismi di malattia che possono essere di aiuto nello sviluppo di terapie migliori e le strategie per prevenire l’infezione. Diretti strumenti analitici che permettono lo studio delle interazioni ospite-patogeno sono essenziali verso questo fine. Cella singola analisi fornisce l’unico mezzo per attribuire inequivocabilmente un fenotipo cellulare ad un particolare genotipo o infezione di stato¹. Ad esempio, infezioni da patogeni inducono frequentemente modifiche dirette e indirette in cellule ospiti. Pertanto, distinguendo le cellule infettate dalle loro controparti non infetti è necessario attributo host cella modifiche o infezione diretta o effetti secondari, come generalizzata infiammazione. Inoltre, per molti agenti patogeni, come SIV e virus di immunodeficenza umana (HIV), infezione delle cellule ospite procede attraverso fasi multiple, come presto, tardi, o latente, ognuno dei quali può essere caratterizzato da distinte gene e della proteina espressione profili^{2 , 3 , 4 , 5}. analisi di massa di miscele di cella non riuscirà a catturare questa eterogeneità⁶. Al contrario, altamente multiplexed analisi unicellulare in grado di quantificare l’espressione di entrambi virale e geni ospitanti offrono un mezzo per risolvere specifici di infezione cellulare perturbazioni, comprese le varianti attraverso fasi di infezione. Ulteriormente, analizzando fisiologicamente interazioni ospite-patogeno in impostazioni rilevanti è fondamentale per l’identificazione di eventi che si verificano negli organismi infetti. Così, metodi che possono essere applicati direttamente ex vivo sono probabilmente migliori cattura in vivo i processi.

SIV e HIV CD4 di destinazione⁺ T cellule, in cui essi neutralizzare fattori antivirali “restrizione” ospite e downregulate antigene che presenta molecole per stabilire l’infezione produttiva ed evitare la sorveglianza immune^{7,8, 9,10,11}. Senza trattamento, l’infezione si traduce in perdita massiccia di CD4 cellule⁺ T, in ultima analisi si conclude con acquistata di immunodeficenza (AIDS) la sindrome¹². L’impostazione della terapia antiretrovirale, serbatoi latente infettate delle cellule persistono per decenni, che propone una formidabile barriera alle strategie curative. Comprendere le proprietà delle cellule in vivo HIV/SIV-infettati ha il potenziale per rivelare caratteristiche della cellula ospite strumentale nella patogenesi e persistenza. Tuttavia, questo è stato molto impegnativo, soprattutto dovuto le evacuazioni delle cellule infettate e mancanza di reagenti in grado di identificare prontamente. Cellule che trascrivono RNA virale, sono valutati per essere presente al 0,01 – 1% di CD4⁺ T cellule nel sangue e tessuto linfoide^13,14,15. Sotto terapia soppressiva, cellule latente infettate sono anche meno frequenti al 10^-3-10^{-7 16,17,18}. Colorazione delle proteine virali saggi che lavorano bene per studiare in vitro infezioni, ad esempio per Gag intracellulare, sono non ottimale a causa di una colorazione di fondo di 0,01 – 0,1%, simile o maggiore della frequenza di cellule infettate^{13, 14}. Marcatura di superficie per la proteina Env usando gli anticorpi monoclonali SIV/HIV Env-specifici ben caratterizzati inoltre ha dimostrato di essere difficile, probabilmente per motivi analoghi. Recentemente, nuovi strumenti mirano a migliorare la rilevazione di cellule esprimenti Gag da uno che incorporano dosaggi specifici per bavaglio RNA o utilizzando alternativo imaging technologies^14,15,19. Tuttavia, tali approcci rimangono limitati nel numero di misurazioni quantitative eseguite su ciascuna cella.

Qui, descriviamo la metodologia che (1) identifica singole cellule infettate da virus direttamente ex vivo di qPCR quantitativa sensibile e specifico gene virale e (2) quantifica l’espressione di proteine di superficie fino a 18 e 96 geni per ogni infettati (e delle cellule non infette). Questa metodologia combina la misurazione di cella singola proteina di superficie di FACS seguita da lisi cellulare immediato e analisi di espressione genica utilizzando multiplexed qPCR mirata sull’apparato Biomark. La tecnologia del circuito integrato fluidico (IFC) consente di multiplex quantificazione di 96 geni da 96 campioni contemporaneamente, compiuta da una matrice di 9.216 alloggiamenti in cui vengono eseguite le reazioni individuali qPCR. L’ordinamento di cellule vive FACS registra ad alto contenuto proteico abbondanza misure mentre conservando l’intero trascrittoma per analisi eseguita immediatamente a valle. Per identificare le cellule infettate da virus, specifici saggi per alternativamente impiombate e unspliced virali RNA (vRNA) sono inclusi nell’analisi qPCR, insieme a un pannello di analisi definite dall’utente per un totale di fino a 96 geni, il numero massimo di analisi attualmente alloggiati in l’IFC. L’espressione genica e proteica informazioni raccolte per ogni cella sono collegate da ben posizionato. Precedentemente abbiamo segnalato i risultati di questa analisi altrove²⁰. Qui, forniamo più dettagliate linee guida metodologiche, nonché ulteriormente descrittivo fenotipizzazione di SIV-infettati CD4⁺ T cellule.

Questo approccio, che chiamiamo tSCEPTRE, può essere applicato per le sospensioni di qualsiasi popolazione di cellule vitali reattivo agli anticorpi fluorescente identificati e che esprimono un transcriptome compatibile con saggi qPCR disponibili. Ad esempio, può essere utilizzato per la caratterizzazione genica differenziale ed espressione della proteina in cellule rare o cellule non facilmente distinguibili dai marcatori di proteina di superficie. La preparazione del campione si basa su uno standard di protocollo utilizzando anticorpi commerciali di colorazione. Citometri con cella singola funzionalità di ordinamento sono anche disponibili in commercio, ma biosicurezza ulteriori precauzioni sono necessarie per l’elaborazione di cellule vive infettive. Registrare il profilo di espressione di proteina delle cellule di singolo – per ogni cella di posizione ben, qui indicato come indicizzato l’ordinamento, è una caratteristica comune di FACS commercialmente disponibile software di ordinamento. Analisi computazionale di geni differenzialmente espressi ospitanti tra popolazioni cellulari di interesse non è descritto qui, ma vengono forniti riferimenti ai metodi precedentemente pubblicati.