L’obiettivo del presente protocollo è quello di ottenere campioni di RNA ad alta integrità dai gangli enterici isolati dal tessuto intestinale umano non fissato, appena resecato mediante microdissezione laser (LCM). Questo protocollo prevede preparazione flash-congelati campioni di tessuto intestinale umano, cryosectioning, colorazione etanolica e disidratazione, LCM e l’estrazione di RNA.
Lo scopo di questo metodo è quello di ottenere campioni di RNA ad alta integrità dai gangli enterici raccolti da tessuto intestinale umano non fissato, appena resecato mediante microdissezione laser (LCM). Abbiamo identificato cinque passaggi del flusso di lavoro che sono cruciali per l’ottenimento di RNA isolati dai gangli enterici con sufficientemente alta qualità e quantità per RNA-seq. In primo luogo, quando si prepara il tessuto intestinale, ogni campione deve avere tutto il liquido in eccesso rimosso dal macchiare prima della spianatura serosa quanto possibile nella parte inferiore della grande stampi base. I campioni allora rapidamente sono congelati in cima a una miscela di ghiaccio secco e 2-metilbutano. In secondo luogo, durante il taglio del tessuto, è importante posizionare cryomolds modo che sezioni intestinali in parallelo il piano completo del plesso mioenterico, producendo quindi il maggiore della superficie dei gangli enterici per ogni diapositiva. Terzo, durante LCM, polietilene napthalate (PEN)-diapositive di membrana offrono la massima velocità e flessibilità nel delineare le forme non uniforme dei gangli enterici durante la raccolta dei gangli enterici. In quarto luogo, per la visualizzazione distinte dei gangli enterici all’interno delle sezioni, etanolo compatibile con coloranti, come la viola di Cresyl, offrono ottima conservazione dell’integrità di RNA rispetto acquose coloranti. Infine, per l’estrazione di RNA da gangli catturati, abbiamo osservato le differenze tra kit commerciali di estrazione RNA che restituito superior RNA quantità e qualità, eliminando la contaminazione del DNA. Ottimizzazione di questi fattori nel protocollo corrente notevolmente accelera il flusso di lavoro e produce campioni di gangli enterici con eccezionale qualità di RNA e la quantità.
Questo metodo è progettato per ottenere campioni di RNA di alta qualità dei gangli enterici da tessuto intestinale umano mediante microdissezione laser (LCM). Il protocollo descritto qui è stato ottimizzato per fornire sufficiente qualità di RNA e rendimenti per RNA (RNA-seq) di sequenziamento ed è destinato a essere utilizzato con tessuto intestinale umano appena resecato, slegato, flash-congelato.
Disturbi funzionali della motilità gastrointestinale dell’intestino ed interessano uno su quattro persone negli Stati Uniti. Il sistema nervoso enterico (ENS), noto anche come il secondo cervello1, è spesso al centro di questi disordini, che svolge un ruolo fondamentale nell’omeostasi dell’intestino e motilità. Manipolazione della motilità intestinale è stato generalmente limitato a resezione chirurgica del tessuto aganglionic/noncontractile, modifica dietetica cronica e/o farmaci. Sorprendentemente, il trascrittoma completo del ENS adulto rimane essere sequenziato, limitando notevolmente la nostra capacità di identificare le molecole all’interno l’ENS che possono essere mirati farmacologicamente o utilizzate nelle terapie con cellule staminali.
Ci sono relativamente pochi metodi per l’isolamento di RNA dai gangli enterici umani. Il primo approccio, cella dissociazione2, richiede temperature di incubazione elevate e tempi di incubazione lungo; sia di cui sono noti per promuovere la degradazione del RNA e alterare il trascrittoma2,3. Un approccio alternativo, LCM, più attendibilmente conserva il trascrittoma e protegge l’integrità del RNA. Anche se parecchi studi hanno utilizzato LCM per raccogliere dei gangli da tessuto intestinale umano fresco congelato4,5,6, questi approcci erano sia ostacolata dalla scarsa qualità di RNA e la quantità, erano abbastanza laboriosi, o necessaria modifica di colorazione o di tecniche di estrazione di RNA a lavorare nelle nostre mani. Altri protocolli di LCM progettati per la conservazione del RNA che sono stati trovati nel prodotto di LCM manuali forniti ulteriori miglioramenti7,8, ma l’adattamento è stato necessario quando applicato all’isolamento di gangli enterici8, 9. per queste ragioni, abbiamo sviluppato un protocollo ottimizzato basato su queste risorse che produce notevoli quantità di RNA ad alta integrità dai gangli enterici umani, ha un flusso di lavoro relativamente veloce e produce risultati coerenti attraverso un grande numero di campioni.
In questo studio, presentiamo una sintesi delle procedure ottimizzate che facilitano l’isolamento di RNA ad alta integrità dai gangli enterici provenienti da tessuto intestinale umano resecato. Il nostro metodo incorpora cinque aspetti importanti. Primi, appena resecato, unfixed campioni intestinali umani devono essere tagliati a misura, hanno tutta l’umidità in eccesso rimossi con un tessuto di laboratorio e appiattito in un grande stampo base prima del flash-congelamento in cima ad una miscela di ghiaccio secco e 2-metilbutano (2 MB). Seconda sezioni istologiche dell’intestino dovrebbero essere preparate per ottenere il piano completo del plesso myenteric in una diapositiva, che offre un payload di grandi dimensioni dei gangli enterici. Successo con questo passaggio dipende in larga misura il processo di preparazione del tessuto. In terzo luogo, la struttura non uniforme dei gangli in ENS richiede l’utilizzo di polietilene napthalate (PEN) membrana diapositive6, che offrono la massima velocità e precisione durante il processo di LCM. Coloranti quarto, etanolo-compatibile, ad esempio Cresyl Violet, dovrebbero essere utilizzati per preservare l’integrità di RNA durante la macchiatura dei gangli enterici. Infine, il processo di estrazione di RNA è fondamentale per un risultato di successo con RNA-seq. Abbiamo cercato un approccio di estrazione di RNA che produce alta integrità di RNA, massimizza RNA rendimenti quando si inizia con piccole collezioni di gangli enterici, Elimina la contaminazione di DNA e conserva specie di RNA come molti come possibile.
Presi insieme, ottimizzazione di questi fattori nel presente studio notevolmente accelera il flusso di lavoro e produce campioni dei gangli enterici con eccezionale quantità di RNA e di qualità. Risultati sono stati in gran parte coerenti tra un considerevole gruppo di campioni, che indica la consistenza di questo approccio. Inoltre, abbiamo usato questi approcci per sequenziato decine di campioni di RNA dai gangli enterici. Le strategie evidenziate qui possono anche essere ampiamente adattate per l’esecuzione di LCM di gangli desiderati o i nuclei dell’unità periferica e del sistema nervoso centrale e altri casi che richiedono l’isolamento di RNA di alta qualità.
Questa procedura consente la raccolta efficiente dei numerosi gangli enterici come fonte per la derivazione di RNA per RNA-seq. Qui, abbiamo abbiamo accelerato i processi illustrati in protocolli esistenti mantenendo al massimo l’integrità del RNA. Come tutti i passaggi di questa procedura sono interdipendenti, è importante che tutti i problemi verranno eliminati dall’inizio dello studio e che tutti i campioni sono preparati come similmente ad uno altro come possibile, per ottenere affidabile RNA-seq.
<p class="jov…The authors have nothing to disclose.
Siamo grati per i donatori e le loro famiglie che hanno reso possibile questo lavoro. Apprezziamo anche l’assistenza di personale presso l’International Institute of Medicine e Tennessee Servizi per i donatori per aiutare la raccolta delle coordinate del tessuto utilizzato in questo studio. Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni dal National Institutes of Health, NIH OT2-OD023850 per supporto di EMS2 e stipendio da NIH T32-DK007673 a AMZ. Siamo grati al personale della Vanderbilt traslazionale patologia ha condiviso risorsa per l’accesso allo strumento di LCM e consigli sulla preparazione dei tessuti. La risorsa ha condiviso la foto di Vanderbilt tessuto patologia è sostenuta in parte da sovvenzioni NIH P30-CA068485-14 e U24-DK059637-13. Ringraziamo il genoma Technology Center di accesso del dipartimento di genetica presso la Washington University School of Medicine per aiuto con analisi genomica. Il GTAC è parzialmente supportato da NCI Cancer Center Support Grant #P30 CA91842 alla Siteman Cancer Center e da TIC/CTSA Grant #UL1TR002345 dal centro nazionale per ricerca risorse (NCRR), un componente del National Institutes of Health (NIH) e NIH Tabella di marcia per la ricerca medica. Questa pubblicazione è di esclusiva responsabilità degli autori e non rappresentano necessariamente la posizione ufficiale di NCRR o NIH.
10% Neutral-buffered formalin | Sigma | HT501128-4L | |
2-Methylbutane | Fisher | O3551-4 | |
3-mL syringe | BD | 309628 | |
50-mL conical tubes, polypropylene | Corning | 05-526B | |
Base molds 37x24x5mm, disposable | Electron Microscopy Sciences | 5025511 | |
Belzer UW Cold Storage Solution | Bridge to Life | N.A. | |
CapSure Macro LCM caps | Arcturus, ThermoFisher | LCM0211 | |
Cling Wrap, Press’n Seal | Glad | N.A. | |
Cresyl Violet Acetate | Acros Organics | AC405760025 | |
Cutting Board | Electron Microscopy Sciences | 63308 | |
Ethanol, 190-proof | Pharmco-AAPER | 111000190 | |
Ethanol, 200-proof | Pharmco-AAPER | 111000200 | |
Glass Microscope slides | Fisher | 12-550-343 | |
Gloves, extended cuff | Microflex | 19010144 | |
Gowns, surgical-disposable | Kimberly-Clark | 19-088-2116 | |
Tray, 20 L (large polypropylene sterilizing pan) | Nalgene | 1335920B | |
Kimwipes (large) | Kimberly-Clark | 34120 | |
Kimwipes (small) | Kimberly-Clark | 34133 | |
Laser Capture Microdissection System (ArcturusXT) | ThermoFisher | N.A. | |
Leica Cryostat Chuck, large, 40 mm | Southeast Pathology Instrument Service | N.A. | |
Light Microscope | Olympus | CX43 | |
Microscope objective (20X) | Olympus UPlanFl 20X/0.50, ∞/0.17 | N.A. | |
Microscope objective (10X) | Olympus UPlanFl 10X/0.25, ∞/- | N.A. | |
Molecular Sieves | Acros Organics | AC197255000 | |
Nuclease-free water | Ambion | AM9937 | |
PicoPure RNA extraction kit | Applied Biosystems | 12204-01 | |
Pellet Pestle | Kimble Kontes | 4621973 | |
PEN membrane LCM slides | Arcturus, ThermoFisher | LCM022 | |
RNase-free tubes, 1.5 mL | Ambion | AM12400 | |
RNaseZAP | Sigma | Sigma-R2020 | |
RNA Extraction Kit "A" (PicoPure) | Applied Biosystems | 12204-01 | |
RNA Extraction Kit "B" (RNeasy Micro kit) | Qiagen | 74004 | |
RNA Extraction Method "C" (TRIzol) | Invitrogen | 15596-026 | |
RNA Extraction Kit "D" (RNeasy PLUS Mini kit) | Qiagen | 74134 | |
Splash Shield, disposable faceshield | Fisher | 17-310 | |
Scissors, Surgical, 14.5 cm "sharp-sharp" | Fine Science Tools | 14002-14 | |
Syringe filter, cellulose acetate (0.2 μm) | Nalgene | 190-2520 | |
Tissue Freezing Medium | General Data Healthcare | TFM-5 | |
Xylenes | Fisher | X3P1GAL |