单细胞共轭藻类无性系培养的建立

1. 收集含有藻类的水样 注: 单细胞 conjugatophytes 生长在停滞的淡水地区, 如湖泊、沼泽和稻田。从这些环境之一中收集含藻类的水样, 以产生一种培养菌株。在开始该过程之前需要下列项目: 浮游生物网, 一次性吸管, 和一个瓶子或50毫升管收集水样。 在湖泊环境中使用浮游生物网从水中收集藻类。根据用途, 使用适当的网。注意: 网的上部对水是透水的。被网捕获的藻类集中在浮游生物网的底部容器中。一个粗糙的网格允许小藻类通过。细网容易被堵塞。 将水 (约50毫升) 转移到50毫升管或100毫升塑料瓶。把浓缩的水样带到实验室。 单细胞 conjugatophytes 也生长在沼泽或稻田。在这些浅水区域, 含有藻类的水样可以直接用吸管取样。然后, 将水 (30-50 毫升) 转移到50毫升管或50毫升塑料瓶。注: 水仔细取样在土壤表面之上, 以便样品不包含任何土壤。 2. 藻类的确认 注意: 以下项目是必需的: 放大镜或便携显微镜和60毫米的盘子观察。 为了确认样品中藻类存在于一次性吸管中, 请使用放大镜直接观察样品。注意: 使用此方法可以很容易地观察到大约 400-1000 µm 的较大细胞 (例如,新月 ehrenbergii)。 在便携式显微镜下确认藻类, 将水样倒入塑料实验盘中。 将样品 (约3毫升) 放在60毫米培养皿的上半部分 (盖子) 的内侧, 然后将下半部分放在下部, 其底部朝向盖子的内部, 上面。注: 此方法使样品不动, 使观察更容易。 3. 从巴斯德吸管中制备玻璃毛细管吸管隔离 注意: 在开始该过程之前, 需要下列项目: 灭菌的巴斯德吸管, 一架为巴斯德吸管, 手套, 橡胶灯泡, 精神灯, 甲醇为精神灯, 打火机, 镊子, 垃圾桶为玻璃, 和一个干净的房间或层流流动罩 (如有必要)。 点燃酒精燃烧器。 要生产一个细玻璃毛细管隔离, 确保火焰没有闪烁。锐化火焰, 并在其尖端熔化巴斯德吸管。 用镊子在火焰上加热无菌玻璃巴斯德吸管, 用手和笔尖在橡胶灯泡一侧支承。 把巴斯德吸管脱下火焰, 伸展它。 当玻璃融化时, 迅速从火焰中取出巴斯德吸管, 然后拉。注: 在本实验中, 巴斯德吸管的扩展为 15-20 厘米. 在拉拔过程中, 要确保吸管脱离火焰。 将玻璃毛细管吸管的尖端折断到适当的长度。因为鞠躬的部分是最好的, 它是理想的尖端。注: 在本研究中, 制备了一个 5-10 厘米尖端的玻璃毛细管吸管。 在熔化后一定要丢弃毛细管, 并确认火焰熄灭。 从玻璃毛细管吸管释放出来的气泡表明尖端开口的大小。选择要隔离的单元格的适当大小。大约1毫米气泡是适当的分离新月物种, 与细胞宽度 10-20 µm。 4. 用玻璃毛细管吸管分离单细胞 注: 在启动前需要下列物品: 倒置光镜、手表眼镜、塑料碟和含钙介质的无菌螺纹试管 (表 1) 或条件 ca 中等7。 准备一些手表眼镜 (直径22毫米和1毫米深度), 每只含有1毫升的无菌钙培养基。 将目标单元格与在该字段中收集的水样样本隔离。 将含有靶细胞的水样 (约 30-40 毫升) 倒入塑料盘中。 在用倒置的光镜观察塑料碟中的样品时, 用玻璃毛细管吸管提取单细胞。 在细胞附近带上玻璃毛细管吸管, 用毛细管作用来促进细胞的吸入。 将细胞转移到含有1毫升无菌 CA 培养基的手表玻璃上 (图 1a)。 再用新的玻璃毛细管从不育的钙介质中提取细胞并将其转移到含有无菌 ca 介质的第二个手表玻璃上 (图 1b)。注意: 此过程是重复的, 直到单个单元格被隔离在专版中 (图 1c)。 使用新的玻璃毛细管吸管拾取单细胞, 最后将其转移到包含14毫升 ca 介质或条件 ca 介质的试管中 (图 1d)。在16小时 light:8-h 黑暗周期的2周内, 将样品孵化23摄氏度。注: 细胞增殖的未知因素, 从生长细胞分泌到周围环境中, 包括在条件培养基中以促进细胞分裂4。如果建立克隆文化, 则从培养基4中制备条件 CA 培养基。如果成功, 文化将变成绿色。