الكشف عن هيتيروديميريزيشن Isoforms البروتين باستخدام في الموقع قرب ربط التحليل
Summary
هنا، نحن تظهر كيفية استخدام مقايسة ربط قرب (جيش التحرير الشعبي) لتصور هيتيروديميريزيشن MST1/MST2 في الخلايا الثابتة مع حساسية عالية.
Abstract
تفاعلات البروتين البروتين ينظم مبدأ توجيهيا لإحداث إشارات كثيرة، والكشف عن مثل هذه الأحداث عنصر هام في فهم كيفية تنظيم هذه المسارات وكيفية عملها. هناك العديد من الطرق للكشف عن تفاعلات البروتين البروتين في الخلايا، ولكن عدد قليل نسبيا يمكن استخدامها للكشف عن التفاعلات بين البروتينات الذاتية. أحد هذه الأساليب، مقايسة ربط قرب (جيش التحرير الشعبي)، له العديد من المزايا التوصية باستخدامها. مقارنة بالأساليب الأخرى الشائعة لتحليل التفاعل البروتين-بروتين، جيش التحرير الشعبي الصيني لديه حساسية عالية نسبيا وخصوصية، يمكن أن يؤديها بالتلاعب بالخلية الحد الأدنى، وفي البروتوكول الموضحة هنا، يتطلب اثنين فقط محددة الهدف الأجسام المضادة المستمدة من مختلف الأنواع (مثلاً.، من الماوس والارنب) وكاشف المتخصصة واحد: مجموعة من الأجسام المضادة الثانوية التي هي النوكليوتيد مرتبط تساهميا محددة، عندما جلبت على مقربة من بعضها البعض، إنشاء منهاج أمبليفيابل في الموقع PCR أو المتداول دائرة التضخيم. في هذا العرض التقديمي، نعرض كيفية تطبيق تقنية جيش التحرير الشعبي الصيني تصور التغييرات في قرب MST1 و MST2 في الخلايا الثابتة. الأسلوب الموصوفة في هذه المخطوطة ينطبق خاصة لتحليل الخلايا مما يشير إلى دراسات.
Introduction
تم ربط تعطل إشارات MST1/فرس النهر إلى اضطرابات النمو والتسرطن1. في الثدييات، وتنشيط مؤنزم MST1 و MST2 (فوسفوريلاتي) MOB1 و LATS1/2، هذه الأخيرة التي ثم فوسفوريلاتيس ويحللها المنشط المشارك النسخي البروتين المرتبط بنعم (ياب)2. في شكله النشط (أونفوسفوريلاتيد)، وقد ياب النمطان النشاط، تعزيز النسخ من خلية انتشار الجينات؛ على العكس من ذلك، عندما يتم إلغاء تنشيطه ياب بالمسار فرس النهر، ويتم منع انتشار الخلايا وشجعت المبرمج3. في الأنسجة، MST1 و MST2 موجودة أساسا ك homodimers النشطة، ولكن النمطان المحفزات يمكن أن تزيد من مستويات heterodimers MST1/MST2، وهذه هيتيروديميرس هي غير نشط4. ولكن كيف ينظم هيتيروديميريزيشن MST1/MST2 ما زالت غير مفهومة. كل إنسان-وهيتيروديميرس بالوساطة عن طريق التفاعلات بين مناطق لفائف ملفوف ج-الطرفية MST1 و MST2 المعروفة باسم سارة المجالات5. استخدام في الموقع أثبت جيش التحرير الشعبي الصيني في هذه المقالة، نحن إظهار وجود heterodimers MST1/MST2 في الخلايا خلايا شوان البشرية (HSC) و “الكلي الجنينية البشرية” (HEK-293). جيش التحرير الشعبي الصيني لديه ميزة على أخرى أساليب الكشف عن التفاعل البروتين/البروتين لأنه يسمح بالكشف عن تفاعلات البروتين البروتين الذاتية، التي يمكن تحديدها وقياسها كمياً دون الحاجة للتعبير التحوير أو استخدام العلامات حانمه 6.
إرسال الإشارات تنبيغ مسارات هي تسيطر إلى حد كبير في الرابطة الشرطية من البروتينات المكون. على سبيل المثال، يؤدي تنشيط مستقبلات معظم تيروسين مؤنزم ثنائي هومو أو المتغايرة ورابطة اللاحقة مع إضافية البروتينات الإشارات داخل الخلايا، وهي نفسها شكل مجمعات أخرى. وغرض أسلوب جيش التحرير الشعبي الصيني تصور التقارب بين البروتينات في الخلايا، شريطة أن البروتينات أقل من 30-40 نانومتر وبصرف النظر. عادة ما يتم الكشف عن قرب البروتين بأول حضانة الخلايا مع الأجسام المضادة الأولية المناسبة التي أثيرت في الأنواع المختلفة (على سبيل المثال. وارنب وفار) ضد كل من البروتين المتفاعلة، ثم إضافة الأجسام المضادة الثانوية إبلاغها، يسبر الحمض النووي قبل المقرونة بالقصير. إذا المسابير الحمض النووي على مقربة، في نفس الوقت ربط اليغنوكليوتيد الحمض النووي محددة تربط بين كلا من هذه التحقيقات، تشكل منبرا للتضخيم في الموقع PCR أو المتداول إليه دائرة. تسمح العلامات الفلورية إضافة إلى رد فعل التضخيم التصور البروتينات المتفاعلة، والتي تظهر كنيون النقاط التي يمكن قياسها كمياً والمترجمة إلى مناطق معينة في الخلية7،8، سهولة 9 , 10.
Protocol
Representative Results
Discussion
وجدنا أنه من المفيد استخدام الشرائح الزجاجية الدائرة لهذه التجربة، كما أنها مريحة جداً لإجراء التجربة مع العديد من خطوط الخلايا (14-16)، وليس هناك حاجة تغيير النموذج كل مرة أثناء التحليل المجهري. قد تنشأ مضاعفات قليلة، مثل خطر متزايد للتلوث عبر مع الأجسام المضادة. ولذلك، فإننا نقترح الغسيل ?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ونحن نشكر المختبر تشيرنوف كامل للمساهمة في التحسين والتحقق من هذا البروتوكول، لا سيما رادو ماريا وغالينا سيمينوفا. ونشكر أيضا أندري افيموف مرفق التصوير الخلية في مركز فوكس تشيس للسرطان. وأيد هذا العمل بمنحه من المعاهد الوطنية للصحة (R01 CA148805) إلى جيمي كارتر.
Materials
| Chamber slides | Thermo Fisher Scientific | 178599 | 16 well, glass slide |
| PLA probe Anti-Mouse Minus | Sigma-Aldrich | DUO92004 | Contains 1x Blocking solution, 1x antibody Diluent |
| PLA Probe Anti-Rabbit PLUS | Sigma-Aldrich | DUO92002 | Contains 1x Blocking solution, 1x antibody Diluent |
| Wash Buffers, Flurescence | Sigma-Aldrich | DUO82049 | Contains Wash Buffer A and Wash Buffer B |
| Mounting Medium with DAPI | Sigma-Aldrich | DUO82040 | |
| Detection Reagents Red | Sigma-Aldrich | DUO92008 | Contains 5x Ligation, 1x Ligase, 5x Amlification Red, 1x Polymerase |
| p44/42 MAPK (Erk1/2) Antibody | Cell Signaling | 9102s | |
| Phospho-p44/42 MAPK (Erk1) (Tyr204)/(Erk2) (Tyr187) | Cell Signaling | 5726s | pERK antibody |
| MST2 antibody | Cell Signaling | 3952s | |
| Krs-2 (RJ-5) | Santa Cruz | sc-100449 | MST1 antibody |
| 16% Paraformaldehyde | Electron microscopy sciences | 15710 | Dilute to 4% PFA in PBS for fixing solution |
| Triton x100 | Fisher BioReagents | BP 151-500 | To prepare 0.1% Triton x-100 in 1xPBS for Permeabilization solution |
| Confocal microscopy | Leica TCS SP8, 63x | Image analysis with ImageJ software |
Riferimenti
- Zhou, D., et al. The Nore1B/Mst1 complex restrains antigen receptor-induced proliferation of naïve T cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (51), 20321-20326 (2008).
- Praskova, M., Xia, F., Avruch, J. MOBKL1A/MOBKL1B phosphorylation by MST1 and MST2 inhibits cell proliferation. Current Biology. 18 (5), 311-321 (2008).
- Dan, I., Watanabe, N. M., Kusumi, A. The Ste20 group kinases as regulators of MAP kinase cascades. Trends in Cell Biology. 11 (5), 220-230 (2001).
- Rawat, S. J., et al. H-ras Inhibits the Hippo Pathway by Promoting Mst1/Mst2Heterodimerization. Current Biology. 26 (12), 1556-1563 (2016).
- Creasy, C. L., Ambrose, D. M., Chernoff, J. The Ste20-like protein kinase, Mst1, dimerizes and contains an inhibitory domain. Journal of Biological Chemistry. 271 (35), 21049-21053 (1996).
- Buntru, A., Trepte, P., Klockmeier, K., Schnoegl, S., Wanker, E. E. Current Approaches Toward Quantitative Mapping of the Interactome. Frontiers in Genetics. 74 (7), (2016).
- Greenwood, C., Ruff, D., Kirvell, S., Johnson, G., Dhillon, H. S., Bustin, S. A. Proximity assays for sensitive quantification of proteins. Biomolecular Detection and Quantification. 4, 10-16 (2015).
- Fredriksson, S., et al. Protein detection using proximity-dependent DNA ligation assays. Nature Biotechnology. 20 (5), 473-477 (2002).
- Leuchowius, K. J., et al. Parallel visualization of multiple protein complexes in individual cells in tumor tissue. Molecular & Cellular Proteomics. 12 (6), 1563-1571 (2013).
- Söderberg, O., et al. Direct observation of individual endogenous protein complexes in situ by proximity ligation. Nature Methods. 3 (12), 995-1000 (2006).
