全基因组对真核生物转录误差的监测

基因组提供了精确的生物生命蓝图。为了正确地实施这一蓝图, 对基因组进行精确的转录是很重要的。然而, 转录不太可能是错误的自由。例如, 长期以来已知的 RNA 聚合酶在体外^1、2中很容易出错, 最近发现它们在体内犯下错误, 以及^3、5、6,特别是面对 DNA 损伤^7,8,9,10。这些观察结果表明, 在所有活细胞中, 转录错误不断发生, 这表明它们可能是突变蛋白的有力来源。

这一过程, 称为转录诱变, 不同于经典诱变的两种方式。首先, 与基因突变相比, 转录错误影响有丝分裂和有丝分裂后细胞, 因为它们不依赖 DNA 复制。因此, 研究影响转录保真度的机制, 将对有丝分裂和有丝分裂后细胞的突变负荷提供有价值的见解。有趣的是, 转录错误最近被牵涉到促进蛋白质聚集^11,12,13 , 并已被推测为两种致癌作用¹⁰和细菌耐药性的发展¹⁴。

第二, 与基因突变相比, 转录错误是暂时性的。它们的暂时存在特别具有挑战性, 因为它使转录错误极其难以检测。例如, 虽然几个实验室已经为研究转录诱变设计了有价值的记者化验, 但这些化验只能够测量在有限数量的上下文和模型有机体^4,15的转录误差。为了克服这些局限性, 许多研究人员已经转向 rna 测序技术 (rna 序列), 理论上允许在任何物种的转录中记录转录错误。然而, 这些研究容易混淆的图书馆建设工件, 如反向转录错误, PCR 放大错误, 和容易出错的性质排序本身。例如, 反向 transcriptases 每隔2万个基元就会提交大约一个错误, 而 RNA 聚合酶 (RNAPs) 则每30万个基^5、6将只进行一个错误。由于反向转录的错误率只会使 rna 聚合酶在细胞内的错误率相形见绌, 所以在传统的 rna 序列数据中, 很难区分真实的转录错误和由图书馆准备产生的伪影。图 1a)。

为了解决这个问题, 我们开发了一个优化版本的圆排序 (Cirseq, 或 C 序列从今以后) 化验^5,16。这种检测允许用户检测转录错误和 RNA 中的其他罕见变种在整个转录⁵。循环测序法具有这个名称, 因为这个检测的关键步骤围绕 RNA circularization。一旦 RNA 目标被发送, 他们是反向转录在一个滚动圈的方式, 以产生线性 cDNA 分子, 包含许多副本相同的 RNA 模板。如果其中一个模板中存在错误, 则该错误也会出现在 cDNA 分子中包含的每一个重复项中。相反, 由反向转录、PCR 放大或测序引入的错误倾向于随机产生, 因此只会出现一次或两次重复。因此, 通过为每个 cDNA 分子生成一个一致的序列, 并区分随机错误和所有重复发生的错误, 库构造工件可以有效地与真实的转录错误分离 (图 1b)。

如果使用得当, C 序列分析可以用来准确地检测 RNA 的基替换, 插入和删除的速率, 在整个转录的任何物种 (例如, 见遍历和 Ochman¹⁷)。例如, 我们使用了 C 序列分析法, 提供了全基因组的测量在酵母、果蝇和秀丽线虫中转录的错误率, 单碱分辨率为^5。(未发表的意见)。最初用于精确序列化 RNA 病毒的人群, 这种优化版本的 C 序列分析已经简化, 以尽量减少苛刻的条件, 在图书馆的准备工作, 有助于图书馆建设工件。此外, 通过使用一些商业上可用的套件, 该检测的吞吐量大大提高, 以及其用户友好性。如果使用得当, 这种检测可以准确地检测到数以千计的转录错误每复制, 从而大大提高了以前的研究⁶。总的来说, 这种方法提供了一个强大的工具, 研究转录突变, 并将允许用户获得新的洞察力的机制, 控制转录的真实性在广泛的有机体。