المراقبة على نطاق الجينوم من أخطاء النسخ في الكائنات الحية حقيقية النواة
Summary
يوفر هذا البروتوكول الباحثين مع أداة جديدة لرصد الإخلاص للنسخ في الكائنات نموذج متعددة.
Abstract
دقة النسخ مطلوب للتعبير الصادق عن المعلومات الوراثية. على الرغم من المثير للدهشة، يعرف الكثير عن الآليات التي تتحكم في الإخلاص للنسخ. لملء هذه الفجوة في المعرفة العلمية، ونحن مؤخرا الأمثل المقايسة تسلسل دائرة للكشف عن أخطاء النسخ في جميع أنحاء الترنسكربيتوم Saccharomyces cerevisiaeو المورفولوجية ميلانوجاستير كاينورهابديتيس ايليجانس. وسيوفر هذا البروتوكول الباحثين مع أداة قوية جديدة تعيين المناظر الطبيعية أخطاء النسخ في الخلايا حقيقية النواة بحيث يمكن توضيح الآليات التي تتحكم في الإخلاص للنسخ بتفصيل لم يسبق له مثيل.
Introduction
الجينوم يوفر مخططا بيولوجية دقيقة للحياة. لتنفيذ هذا المخطط بشكل صحيح، من المهم للجينوم يتم نسخها بدقة كبيرة. ومع ذلك، النسخ من غير المرجح أن تكون خالية من الأخطاء. على سبيل المثال، رنا بولمرس منذ فترة طويلة من المعروف أن يكون عرضه للخطأ في المختبر1،2، ومؤخرا فقد تبين أنهم يرتكبون أخطاء في فيفو فضلا عن3،،من56، لا سيما عندما تواجه مع الحمض النووي الضرر7،،من89،10. وتشير هذه الملاحظات مجتمعة، إلى أن أخطاء النسخ تحدث باستمرار في جميع الخلايا الحية، مما يوحي بأنها يمكن أن تكون مصدرا قويا للبروتينات المتحولة.
هذه العملية، ووصف الطفرات النسخي، يختلف عن الطفرات الكلاسيكية بطريقتين. أولاً، على عكس الطفرات الوراثية، أخطاء النسخ تؤثر على الخلايا الانقسامية والانقسامية اللاحقة على حد سواء، كما أنها لا تعتمد على تكرار الحمض النووي. ولذلك، دراسة الآليات التي تؤثر على الإخلاص للنسخ سيوفر نظرة متعمقة في التحميل تحور الخلايا الانقسامية والانقسامية اللاحقة على حد سواء. من المثير للاهتمام، تورطت مؤخرا في الترويج للبروتين تجميع11،،من1213 أخطاء النسخ وقد تم الافتراض بالإسهام في كلا التسرطن10 تطوير المقاومة للمضادات الحيوية في البكتيريا14.
ثانيا، على النقيض من الطفرات الوراثية، أخطاء النسخ عابرة في الطبيعة. وجودها مؤقت يشكل تحديا كبيرا لأنه يجعل من الصعوبة للكشف عن أخطاء النسخ. على سبيل المثال، في حين وضعت عدة مختبرات فحوصات مراسل قيماً لدراسة الطفرات النسخي، هذه فحوصات فقط قادرة على قياس أخطاء النسخ في عدد محدود من سياقات ونموذج الكائنات الحية4،15. للتغلب على هذه القيود، تحولت العديد من الباحثين لتكنولوجيا تسلسل الحمض النووي الريبي (الرنا-seq)، الذي يسمح نظرياً أخطاء النسخ التي سيتم تسجيلها في جميع أنحاء الترنسكربيتوم من أي نوع. ومع ذلك، هذه الدراسات بسهولة خلطت بين من التحف بناء مكتبة، مثل أخطاء النسخ العكسي، وبكر تضخيم الأخطاء، وطبيعة التسلسل نفسه عرضه للخطأ. على سبيل المثال، ترانسكريبتاسيس عكس ارتكاب خطأ واحد تقريبا كل القواعد ~ 20,000، بينما يتوقع رنا بولمرس (رنابس) لجعل خطأ واحد فقط كل5،القواعد 300,0006. لأن نسبة الخطأ لوحدها عكس النسخ الأقزام بمعدل خطأ رنا بولمرس داخل الخلايا، يكاد يكون من المستحيل التمييز بين أخطاء النسخ الحقيقية من النتائج الملموسة الناجمة عن إعداد مكتبة في بيانات تسلسل الحمض النووي الريبي التقليدية ( الشكل 1a).
لحل هذه المشكلة، قمنا بتطوير نسخة محسنة من الدائرة-التسلسل (سيرسيق، أو ج-seq من الآن فصاعدا) الإنزيم5،16. هذا التحليل يسمح للمستخدم بالكشف عن أخطاء النسخ وغيرها من المتغيرات نادرة في الجيش الملكي النيبالي في جميع أنحاء الترنسكربيتوم5. مقايسة تسلسل التعميم يحمل هذا الاسم لأنه خطوة رئيسية في هذا التحليل تدور حول على الحمض النووي الريبي. حالما يتم سيركولاريزيد أهداف الجيش الملكي النيبالي، وهم عكس نسخها بطريقة دائرة متداول، لإنتاج جزيئات كدنا الخطية التي تحتوي على نسخ عديدة من نفس القالب الجيش الملكي النيبالي. إذا كان خطأ كان حاضرا في أحد هذه القوالب، سيكون أيضا حاضرا في كل تكرار واحد الواردة ضمن الجزيء كدنا هذا الخطأ. على النقيض من ذلك، أخطاء عرض النسخ العكسي، [بكر] تضخيم أو تسلسل تميل إلى أن تنشأ عشوائياً، وهكذا سيكون حاضرا في تكرار واحد أو اثنين فقط. وهكذا، بتوليد تسلسل توافق آراء لكل جزيء كدنا، والتمييز بين أخطاء عشوائية من الأخطاء التي تحدث في كل تكرار، التحف بناء مكتبة يمكن فعلياً فصل من أخطاء النسخ الحقيقية (الشكل 1b).
إذا استخدمت بشكل صحيح، يمكن استخدام مقايسة ج-seq دقة الكشف عن معدل استبدال قاعدة وعمليات الإدراج والحذف في الجيش الملكي النيبالي في جميع أنحاء الترنسكربيتوم من أي نوع (على سبيل المثال، انظر الاعتراضية و Ochman17). على سبيل المثال، أننا استخدمنا التحليل ج-seq توفير قياسات المجين على نطاق المنظومة لمعدل خطأ النسخ في Saccharomyces cerevisiaeو المورفولوجية melanogaster ايليجانس كاينورهابديتيس بقرار واحد لقاعدة5 (غير منشورة الملاحظات). المستخدمة في الأصل لدقة تسلسل السكان فيروسات الرنا، تم تبسيط هذا الإصدار الأمثل من التحليل ج-seq للتقليل من الظروف القاسية أثناء إعداد المكتبة التي تسهم في بناء مكتبة التحف. وبالإضافة إلى ذلك، باستخدام عدد من مجموعات المتاحة تجارياً، الإنتاجية من الفحص هو تحسن كبير، كذلك سهولة. هذا التحليل بدقة إذا ما استخدمت بشكل صحيح، يمكن اكتشاف آلاف أخطاء النسخ كل تكرار، وبذلك تحسنت في الدراسات السابقة6. وعموما، هذا الأسلوب يوفر أداة قوية لدراسة الطفرات النسخي وسوف تسمح للمستخدم بالحصول على رؤى جديدة في الآليات التي تتحكم في الإخلاص للنسخ في طائفة واسعة من الكائنات الحية.
Protocol
Representative Results
Discussion
وهنا يصف لنا بروتوكولا أمثل لإعداد مكتبات ج-seq للكشف عن أخطاء النسخ في Saccharomyces cerevisiaeو المورفولوجية melanogaster ايليجانس كاينورهابديتيس. هذا البروتوكول له مزايا عديدة على البروتوكولات القائمة، فضلا عن تقنيات بديلة.
على مدى السنوات ال 15 الماضية، العديد من نظم مراسل…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وأمكن هذا المنشور بتمويل من منحة T32ES019851 (إلى فريتش جيم)، R01AG054641، ومحقق شباب عفر منح (إلى فرمولست م.).
Materials
| RiboPure RNA purification kit | ThermoFisher | AM1926 | Total RNA purification |
| Genelute mRNA purification kit | Sigma-Aldrich | MRN70-1KT | mRNA purification |
| Nuclease-free Water | Ambion | AM9937 | Elution and dilution |
| Ambion RNase III | ThermoFisher | AM2290 | RNA fragmentation |
| T4 RNA Ligase 1 (ssRNA Ligase) | New England Biolabs | M0204S | RNA circularization |
| Ribolock | ThermoFisher | EO0381 | RNase inhibitor |
| SuperScript III Reverse Transcriptase | ThermoFisher | 18080044 | Rolling circle reverse transcription |
| 10 mM dNTP mix | ThermoFisher | 18427013 | Rolling circle reverse transcription |
| Random hexamers (50 ng/µl) | ThermoFisher | N8080127 | Rolling circle reverse transcription |
| NEB Second Strand Synthesis Module | New England Biolabs | E6111S | Second Strand Synthesis |
| NEBNext Ultra DNA Library Prep Kit for Illumina | New England Biolabs | E7370S | cDNA library preparation |
| NEB Next index primers | NEB | E7335S | Multiplex PCR primers |
| Oligo Clean & Concentrator | Zymo Research | D4061 | Clean up of RNA and DNA samples |
| DynaMag-2 Magnet | ThermoFisher | 12321D | Magnetic bead purification |
| AMPure XP beads | Beckman Coulter | A63881 | Magnetic bead purification |
| Eppendorf 5424 Microcentrifuge | FisherScientific | 05-403-93 | centrifugation |
| INCU-Shaker 10L | Benchmark Scientific | H1010 | Cell culture |
| T100 Thermal Cycler | BIO RAD | 1861096 | Medium to High temperature cycling conditions |
| PTC-200 Thermal Cycler | GMI | 8252-30-0001 | Low temperature cycling conditions |
| RNase Away | Molecular Bioproducts | 700S-11 | Sterilization |
| 50 ml Centrifuge Tube | Corning | 430290 | Nuclease-free |
| 15 ml Centrifuge Tube | Corning | 430052 | Nuclease-free |
| Eppendorf tubes | USA Scientific | 1615-5500 | Nuclease-free |
| 4200 Tapestation System | Agilent | G2991AA | Nucleotide analysis instrument for quality control of RNA and single stranded DNA samples |
| High Sensitivity RNA Screen Tape | Agilent | 5067-5579 | Quality control of RNA and single stranded DNA samples |
| RNA ScreenTape Sample Buffer | Agilent | 5067-5577 | Quality control of RNA and single stranded DNA samples |
| RNA ScreenTape Ladder | Agilent | 5067-5578 | Quality control of RNA and single stranded DNA samples |
| 2100 Bioanalyzer Instrument | Agilent | G2939BA | Double stranded DNA quality control |
| High Sensitivity DNA Kit | Agilent | 5067-4626 | Quality control for double stranded cDNA samples |
| Water Bath | VWR | 462-0244 | Incubation |
| NanoDrop 2000/2000C Spectrophotometer | ThermoFisher | ND-2000C | Determination of RNA concentration |
Riferimenti
- Kireeva, M. L., et al. Transient reversal of RNA polymerase II active site closing controls fidelity of transcription elongation. Molecular Cell. 30, 557-566 (2008).
- Walmacq, C., et al. Rpb9 subunit controls transcription fidelity by delaying NTP sequestration in RNA polymerase II. The Journal of Biological Chemistry. 284, 19601-19612 (2009).
- Strathern, J., et al. The fidelity of transcription: RPB1 (RPO21) mutations that increase transcriptional slippage in S. cerevisiae. The Journal of Biological Chemistry. 288, 2689-2699 (2013).
- Irvin, J. D., et al. A genetic assay for transcription errors reveals multilayer control of RNA polymerase II fidelity. PLoS Genetics. 10, e1004532 (2014).
- Gout, J. F., et al. The landscape of transcription errors in eukaryotic cells. Science Advances. 3, e1701484 (2017).
- Gout, J. F., Thomas, W. K., Smith, Z., Okamoto, K., Lynch, M. Large-scale detection of in vivo transcription errors. Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 110, 18584-18589 (2013).
- Viswanathan, A., You, H. J., Doetsch, P. W. Phenotypic change caused by transcriptional bypass of uracil in nondividing cells. Science. 284, 159-162 (1999).
- Bregeon, D., Doddridge, Z. A., You, H. J., Weiss, B., Doetsch, P. W. Transcriptional mutagenesis induced by uracil and 8-oxoguanine in Escherichia coli. Molecular Cell. 12, 959-970 (2003).
- Saxowsky, T. T., Doetsch, P. W. RNA polymerase encounters with DNA damage: transcription-coupled repair or transcriptional mutagenesis. Chemical Reviews. 106, 474-488 (2006).
- Saxowsky, T. T., Meadows, K. L., Klungland, A., Doetsch, P. W. 8-Oxoguanine-mediated transcriptional mutagenesis causes Ras activation in mammalian cells. Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 105, 18877-18882 (2008).
- Vermulst, M., et al. Transcription errors induce proteotoxic stress and shorten cellular lifespan. Nature Communications. 6, 8065 (2015).
- van Leeuwen, F. W., Burbach, J. P., Hol, E. M. Mutations in RNA: a first example of molecular misreading in Alzheimer’s disease. Trends in Neurosciences. 21, 331-335 (1998).
- van Leeuwen, F. W., et al. Frameshift mutants of beta amyloid precursor protein and ubiquitin-B in Alzheimer’s and Down patients. Science. 279, 242-247 (1998).
- Morreall, J. F., Petrova, L., Doetsch, P. W. Transcriptional mutagenesis and its potential roles in the etiology of cancer and bacterial antibiotic resistance. Journal of Cellular Physiology. 228, 2257-2261 (2013).
- Strathern, J. N., Jin, D. J., Court, D. L., Kashlev, M. Isolation and characterization of transcription fidelity mutants. Biochimica et Biophysica Acta. 1819, 694-699 (2012).
- Acevedo, A., Andino, R. Library preparation for highly accurate population sequencing of RNA viruses. Nature Protocols. 9, 1760-1769 (2014).
- Traverse, C. C., Ochman, H. Genome-Wide Spectra of Transcription Insertions and Deletions Reveal That Slippage Depends on RNA:DNA Hybrid Complementarity. mBio. 8, (2017).
- Martin, M. Cutadapt Removes Adapter Sequences From High-Throughput Sequencing Reads. EMBnet.journal. 17 (1), 10-12 (2011).
- Kent, W. J. BLAT–the BLAST-like alignment tool. Genome Research. 12, 656-664 (2002).
- Kim, D., et al. TopHat2: accurate alignment of transcriptomes in the presence of insertions, deletions and gene fusions. Genome Biology. 14, R36 (2013).
- Zhou, Y. N., et al. Isolation and characterization of RNA polymerase rpoB mutations that alter transcription slippage during elongation in Escherichia coli. The Journal of Biological Chemistry. 288, 2700-2710 (2013).
- Reid-Bayliss, K. S., Loeb, L. A. Accurate RNA consensus sequencing for high-fidelity detection of transcriptional mutagenesis-induced epimutations. Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 114, 9415-9420 (2017).
