Un saggio di Neurosphere per valutare l'attivazione delle cellule staminali neurali endogene in un modello murino di ferita del midollo spinale Minimal
Summary
Qui, noi dimostrare le prestazioni di un modello di lesione minima del midollo spinale in un topo adulto che risparmia la nicchia di canale centrale alloggiamento cellule staminali neurali endogene (NSC). Vi mostriamo come l’analisi di neurosphere può essere usata per quantificare l’attivazione e migrazione delle CSN definitivo e primitiva dopo la lesione.
Abstract
Cellule staminali neurali (NSC) nel midollo spinale adulto dei mammiferi sono una popolazione relativamente mitoticamente quiescente di periventricular celle che può essere studiato in vitro facendo uso dell’analisi di neurosphere. Questo saggio di formazione di colonie è un potente strumento per studiare la risposta di NSC a fattori esogeni in un piatto; Tuttavia, questo utilizzabile anche per studiare l’effetto delle manipolazioni in vivo con la corretta comprensione dei punti di forza e i limiti del dosaggio. Una manipolazione di interesse clinico è l’effetto della ferita sull’attivazione endogena di NSC. I modelli attuali di ferita del midollo spinale rappresentano una sfida di studiare questo come la gravità di modelli comuni di contusione, la compressione e il transection causano la distruzione della nicchia NSC presso il sito della ferita dove risiedono le cellule staminali. Qui, descriviamo un modello minima ferita che provoca danni localizzati sulla superficie dorsolateral superficiale del più basso livello toracico (T7/8) del midollo spinale di topo adulto. Questo modello di lesione Risparmia il canale centrale a livello della lesione e consente di analizzare il NSC che risiedono a livello della lesione a vari tempi dopo la lesione. Qui, ci mostrano come il saggio di neurosphere può essere utilizzato per studiare l’attivazione di due popolazioni distinte, lineally-correlati, di NSC che risiedono nella regione periventricular del midollo spinale – NSC primitiva e definitiva (pNSCs e dNSCs, rispettivamente). Dimostriamo come isolare e cultura questi NSCs dalla regione a livello della ferita e il sito di lesione della materia bianca periventricular. Nostro post-chirurgica del midollo spinale le dissezioni Visualizza numeri aumentati di pNSC e neurosfere dNSC-derivato dalla regione delle corde feriti rispetto ai controlli, parlando loro attivazione tramite lesioni periventricular. Inoltre, a seguito di infortunio, neurosfere dNSC-derivato può essere isolato dal sito di lesione — che dimostra la capacità di NSC per migrare da loro nicchia periventricular a siti della lesione.
Introduction
Il sistema nervoso centrale contiene una sottopopolazione di cellule staminali multipotenti, autorinnovabile che hanno la capacità di dare origine a tutte le diverse cellule neurali maturo tipi1,2,3,4. Queste cellule staminali neurali (NSC) risiedono in nicchie specializzate nel cervello e nel midollo spinale e può essere attivate a seguito di infortunio per proliferare, migrare e differenziarsi in cellule neurali mature. NSC e la loro progenie sono stati indicati a migrare verso il sito di lesione lesione corticale modelli5,6. Nel cervello, NSC sono state indicate per eseguire la migrazione da ventricoli laterali al sito della ferita dove si differenziano in astrociti che contribuiscono alla formazione di cicatrice gliale7. Nel midollo spinale, tuttavia, pochi studi sono stati fatti per chiedere se queste stesse NSC endogena può essere sfruttata per promuovere il recupero dopo la lesione del midollo spinale. Infatti, c’è attualmente un dibattito su se l’attivazione del pool di cellule staminali nel midollo spinale richiede un danno fisico diretto della nicchia periventricular fodera il canale centrale8 o se il danno al midollo spinale cavo di parenchima (lasciando il gambo nicchia delle cellule intatta) è sufficiente attivare endogeno NSCs9.
Un numero di modelli di lesione (sic) del midollo spinale è stato usato per studiare la fisiopatologia delle lesioni acute e croniche. Questi modelli sono stati utilizzati anche per testare potenziali terapie per il trattamento di SCI attraverso il neuroprotection, immunomodulazione e sviluppo delle cellule trapianto/sostituzione strategie10,11,13. Modelli correnti includono lesioni compressione e/o contusione, che causano i deficit funzionali su larga scala, nonché vaste lesioni e cavitazioni nel cavo14,15. Le cicatrici gliali risultante possono estendersi su diversi segmenti spinali insieme alla maggioranza della circonferenza/larghezza del midollo spinale16. Così, mentre questi modelli sono clinicamente rilevanti, permettersi sfide significative per studiare la risposta di NSC endogena dopo la lesione. Ci sono modelli chimici di lesioni che possono essere adattate per causare lievi forme di pregiudizio che può risparmiare il canale centrale17. Tuttavia, questi tipi di lesioni concentrano sul demyelination connesso con SCI e non sono modelli clinicamente rilevanti per il danno fisico e/o meccanico connesso con sci traumatico.
Per risolvere le limitazioni degli attuali modelli di lesione, abbiamo adattato un ago pista SCI modello minimo, originariamente sviluppato nel ratto9, per l’applicazione in un modello di topo adulto. Il nostro modello adattato ferita può creare una lesione coerenza della regione dorsolateral del midollo spinale del mouse e il canale centrale presso i livelli della ferita di ricambio. Il vantaggio di questo modello è che consente lo studio della cinetica di NSC dopo lesioni e della loro potenziale espansione radiale al sito della ferita. L’uso di un modello del mouse consente anche l’utilizzo di topi transgenici che consentono il rilevamento di lignaggio di NSC endogena e la loro progenie dopo la lesione. Le proprietà di NSC possono essere valutate ulteriormente utilizzando una forma modificata del test in vitro neurosphere che è stato introdotto in questo protocollo.
Il dosaggio di neurosphere è un in vitro formanti colonie test che consente l’isolamento delle CSN in presenza di mitogeni. Alle densità clonale placcatura, NSC individuali proliferano per dare origine a colonie sferiche digalleggiante di cellule che sono costituite da una piccola sottopopolazione delle CSN e una stragrande maggioranza di progenitori18,19. Nel nostro protocollo, dimostriamo l’isolamento di due distinti, lineally senile NSCs dalla regione periventricular del midollo spinale — in condizioni basali e dopo il nostro modello SCI minimo. Definitivo neurale staminali nestina espressa in cellule (dNSCs) e la proteina silicea fibrillare glial (GFAP) e sono coltivate in presenza di fattore di crescita epidermico (EGF), fattore di crescita del fibroblasto (FGF) e l’eparina (insieme definito come EFH)20. Questi dNSCs sono rari nel midollo spinale ingenuo, dando vita a pochissimi neurosfere in vitro. Tuttavia, mostriamo che dNSCs sono attivati dopo SCI minimal, espandendo i numeri di neurosfere isolato dal regione periventricular21. Cellule staminali neurali primitive (pNSCs) sono a Monte del dNSCs del lignaggio delle cellule staminali neurali. pNSCs sono rapidi, eccessivamente rari bassi livelli del marcatore pluripotenza Oct4 e sono la leucemia fattore inibitorio (LiF) reattivo22. pNSCs non fanno neurosfere quando isolato dal midollo spinale di topo adulto a causa della presenza della proteina basica della mielina (MBP) in colture primarie; Tuttavia, pNSC neurosfere possono essere isolate da topi deficienti di MBP e i loro numeri sono estesa lesione seguente — simili a dNSCs21. Infine, mostrare che neurosfere dNSC-derivato può essere isolato dal sito della lesione a presto volte seguito minimo SCI. Questi risultati dimostrano che il nostro modello di lesione e saggi possono valutare le caratteristiche di attivazione di periventricular NSC come la loro capacità di proliferare e migrare in risposta alla lesione.
Protocol
Representative Results
Discussion
Durante la procedura chirurgica, ci sono pochi passaggi critici dove il ricercatore dovrebbe prestare particolare attenzione al fine di ottenere i risultati ottimali e ridurre al minimo la variabilità tra gli animali. Cura deve essere presa con l’anestesia per inalazione (isoflurano) durante la chirurgia come l’anestetico ha dimostrato di avere effetti neuroprotective con esposizione prolungata27. Di conseguenza, quando si studia la capacità rigenerativa del midollo spinale dopo la ferita, fare …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è finanziato dalla Fondazione Krembil (sovvenzione di funzionamento CMM). WX è stato il destinatario del premio studente Carlton Marguerite Smith. NL ha ricevuto una borsa di studio laureato di Ontario.
Materials
| Agricola Retractor | Fine Science Tools | 17005-04 | |
| Moria Vannas-Wolff Spring Scissors (Curved) | Fine Science Tools | 15370-50 | Customize when ordering to get blunted tips |
| Graefe Forceps (Straight, 1×2 Teeth) | Fine Science Tools | 11053-10 | |
| Extra Fine Graefe Forceps (Curved, Serrated) | Fine Science Tools | 11152-10 | Or any other forceps for suturing |
| Hartman Hemostats (Straight) | Fine Science Tools | 13002-10 | Or any other appropriate for suturing |
| Scalpel Handle #3 | Fine Science Tools | 10003-12 | Or any other appropriate |
| Hair clippers | amazon.ca | https://www.amazon.ca/Wahl-Professional-8685-Classic-Clipper/dp/B00011K2BA | or any other appropriate |
| Stereotaxic instrument | Stoeling | 51500 | or any other appropriate |
| Buprenorphine | or any appropirate sanctioned my animal care facility | ||
| Meloxicam | or any appropriate sanctioned by animal care facility | ||
| Tears Naturale P.M. | Alcon | https://www.amazon.ca/Alcon-Tear-Gel-Liquid-Eye-Gel/dp/B00HHXGUXE | or any other appropriate |
| Isoflurane | Baxter International Inc | DIN 02225875 | or any other appropriate for anesthesia |
| Q-tips Cottom Swabs | amazon.ca | https://www.amazon.ca/Q-Tips-Cotton-Swabs-500-Count/dp/B003M5UO6U/ref=pd_lpo_vtph_194_bs_tr_img_1/140-7113119-8364127?_encoding=UTF8&psc=1&refRID=JC16N542KVRF2N62N3DS | |
| Cotton Gauze | Fisher Scientific | 13-761-52 | |
| 30G Needles | Becton Dickinson | 305106 | For Injury |
| 25G Needles | Becton Dickinson | 305122 | For Drug injections |
| 1mL Syringes | Becton Dickinson | 3090659 | for drug injections |
| 3mL Syringes | Becton Dickinson | 309657 | for fluid injections |
| 4-0 Suture | uoftmedstore.com | 2297-VS881 | for skin suturing |
| 6-0 Suture | uoftmedstore.com | VS889 | for muscle suturing |
| Polysporin ointment | amazon.ca | 102051 | |
| Isoflurane Vaporizer | VetEquip | 901806 | |
| 15mL conical tubes | ThermoFisher | Any appropriate | |
| Petri Dishes | ThermoFisher | any appropriate | |
| Trypan Blue | ThermoFisher | Any | |
| Hemocytometer | ThermoFisher | Any appropriate | |
| Centrifuge | ThermoFisher | Any appropriate | |
| Standard Dissection Tools | Fine Science Tools | ||
| Dissection Microscope | Zeiss | Stemi 2000 | |
| Counting Microscope | Olympus | CKX41 | |
| Neural Basal-A Medium | Invitrogen | 10888-022 | |
| B27 | Invitrogen | 17404-044 | |
| Penicillin- Streptomycin | Gibco | 15070 | |
| L- Glutamine | Gibco | 25030 | |
| DMEM | Invitrogen | 12100046 | |
| F12 | Invitrogen | 12700075 | |
| 30% Glucose | Sigma | G6152 | 1M- 9.01g in 100mL dH2O |
| 1M Glucose | |||
| 7.5% NaHCO3 | Sigma | S5761 | 155mM- 1.30g in 100mL dH2O |
| 155mM NaHCO3 | |||
| 1M HEPES | Sigma | H3375 | 23.83 g in 100mL dH2O |
| Apo-Transferrin | R&D Systems | 3188-AT | |
| Putrescine | Sigma | P7505 | |
| Insulin | Sigma | I5500 | |
| Selenium | Sigma | S9133 | |
| Progesterone | Sigma | P6149 | |
| Papain Dissociation System | Worthington Biochemical Corporation | PDS | 1 vial of papain can be used for 2 samples |
| Epidermal Growth Factor | Invitrogen | PMG8041 | Powder reconstituted with 1mL Hormone Mix and aliquoted into 20uL vials to be stored in freezer |
| Fibroblast Growth Factor | Invitrogen | PHG0226 | Powder reconstituted with 0.5mL Hormone Mix and aliquoted into 20uL vials to be stored in freezer |
| Heparin | Sigma | H3149 | |
| Leukemia Inhibitory Factor | In House | ||
| Trypan Blue | |||
| Hemocytometer | |||
| 24 well Plates | NUNC | ||
| 2M NaCl | Sigma | S5886 | 11.69g in 100mL dH2O |
| 1M KCL | Sigma | P5405 | 7.46g in 100mL dH2O |
| 1M MgCl2 | Sigma | M2393 | 20.33g in 100mL dH2O |
| 108mM CaCl2 | Sigma | C7902 | 1.59g in 100mL dH2O |
Riferimenti
- Johansson, C. B., et al. Identification of a neural stem cell in the adult mammalian central nervous system. Cell. 96 (1), 25-34 (1999).
- McKay, R. Stem cells in the central nervous system. Science. 276 (5309), 66-71 (1997).
- Gage, F. H. Mammalian neural stem cells. Science. 287 (5457), 1433-1438 (2000).
- Temple, S., Alvarez-Buylla, A. Stem cells in the adult mammalian central nervous system. Current Opinion in Neurology. 9 (1), 135-141 (1999).
- Zhang, R., et al. Activated neural stem cells contribute to stroke-induced neurogenesis and neuroblast migration toward the infarct boundary in adult rats. Journal Of Cerebral Blood Flow And Metabolism. 24 (4), 441-448 (2004).
- Komitova, M., Mattsson, B., Johansson, B. B., Eriksson, P. S. Enriched environment increases neural stem/progenitor cell proliferation and neurogenesis in the subventricular zone of stroke-lesioned adult rats. Stroke. 36 (6), 1278-1282 (2005).
- Faiz, M., et al. Adult neural stem cells from the subventricular zone give rise to reactive astrocytes in the cortex after stroke. Cell Stem Cell. 17 (5), 624-634 (2015).
- Ren, Y., et al. Ependymal cell contribution to scar formation after spinal cord injury is minimal, local and dependent on direct ependymal injury. Science Reports – UK. 7, (2017).
- Mothe, A. J., Tator, C. H. Proliferation, migration, and differentiation of endogenous ependymal region stem/progenitor cells following minimal spinal cord injury in the adult rat. Neuroscienze. 131 (1), 177-187 (2005).
- Thuret, S., Moon, L. D., Gage, F. H. Therapeutic interventions after spinal cord injury. Nature Reviews Neuroscience. 7 (8), 628-643 (2006).
- Bethea, J. R., et al. Systemically administered interleukin-10 reduces tumor necrosis factor-alpha production and significantly improves functional recovery following traumatic spinal cord injury in rats. Journal of Neurotrauma. 16 (10), 851-863 (1999).
- Donnelly, D. J., Popovich, P. G. Inflammation and its role in neuroprotection, axonal regeneration and functional recovery after spinal cord injury. Experimental Neurology. 209 (2), 378-388 (2008).
- Cummings, B. J., et al. Human neural stem cells differentiate and promote locomotor recovery in spinal cord-injured mice. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 102 (39), 14069-14074 (2005).
- Beattie, M. S., Hermann, G. E., Rogers, R. C., Bresnahan, J. C. Cell death in models of spinal cord injury. Progress in Brain Research. 137, 37-47 (2002).
- Metz, G. A., et al. Validation of the weight-drop contusion model in rats: a comparative study of human spinal cord injury. Journal of Neurotrauma. 17 (1), 1-17 (2000).
- Faulkner, J. R., et al. Reactive astrocytes protect tissue and preserve function after spinal cord injury. Journal of Neuroscience. 24 (9), 2143-2155 (2004).
- Cheriyan, T., et al. Spinal cord injury models: a review. Spinal Cord. 52 (8), 588-595 (2014).
- Deleyrolle, L. P., Reynolds, B. A. Isolation, expansion, and differentiation of adult Mammalian neural stem and progenitor cells using the neurosphere assay. Neural Cell Transplantation: Methods and Protocols. , 91-101 (2009).
- Singec, I., et al. Defining the actual sensitivity and specificity of the neurosphere assay in stem cell biology. Nature Methods. 3 (10), (2006).
- Mignone, J. L., Kukekov, V., Chiang, A. S., Steindler, D., Enikolopov, G. Neural stem and progenitor cells in nestin-GFP transgenic mice. The Journal of Comparative Neurology. 469 (3), 311-324 (2004).
- Xu, W., et al. Myelin basic protein regulates primitive and definitive neural stem cell proliferation from the adult spinal cord. Stem Cells. 35 (2), 485-496 (2017).
- Sachewsky, N., et al. Primitive neural stem cells in the adult mammalian brain give rise to GFAP-expressing neural stem cells. Stem Cell Reports. 2 (6), 810-824 (2014).
- Mothe, A., Tator, C. H. Isolation of neural stem/progenitor cells from the periventricular region of the adult rat and human spinal cord. Journal of Visualized Experiments. (99), (2015).
- Absher, M. Hemocytometer counting. Tissue Culture. , 395-397 (1973).
- Azari, H., Rahman, M., Sharififar, S., Reynolds, B. A. Isolation and expansion of the adult mouse neural stem cells using the neurosphere assay. Journal of Visualized Experiments. (45), (2010).
- Xiong, L., et al. Preconditioning with isoflurane produces dose-dependent neuroprotection via activation of adenosine triphosphate-regulated potassium channels after focal cerebral ischemia in rats. Anesthesia and Analgesia. 96 (1), 233-237 (2003).
- Metz, G. A., Merkler, D., Dietz, V., Schwab, M. E., Fouad, K. Efficient testing of motor function in spinal cord injured rats. Brain Research. 883 (2), 165-177 (2000).
- Hamers, F. P., Koopmans, G. C., Joosten, E. A. CatWalk-assisted gait analysis in the assessment of spinal cord injury. Journal of Neurotrauma. 23 (3-4), 537-548 (2006).
