زرع هوموتشرونيك إينتيرنيورون السلائف في أوائل العقول الماوس بعد الولادة
Summary
تحدي الشباب من الخلايا العصبية في مناطق الدماغ جديدة يمكن أن تكشف عن معلومات هامة بشأن كيفية البيئة sculpts مصير الخلايا العصبية والنضج. يصف هذا البروتوكول إجراء الحصاد السلائف إينتيرنيورون من مناطق محددة من الدماغ وزرع لهم أما هوموتوبيكالي أو هيتيروتوبيكالي في دماغ الجراء بعد الولادة.
Abstract
تحديد مصير الخلايا العصبية ونضوج يتطلب تفاعل معقدة بين البرامج الوراثية والبيئية الإشارات. ومع ذلك، مقدر أدوار جوهرية مقابل الآليات الخارجية التي تنظم هذه العملية التمايز معضلة لجميع نيوروبيولوجيستس التنموية. يتم تكبير هذه المسألة جابايرجيك إينتيرنيورونس، سكان خلية غير متجانسة بشكل لا يصدق أن يولد من هياكل الجنينية عابرة والخضوع لمرحلة المهاجرة التي طال أمدها لتفريق طوال telencephalon. لاستكشاف مدى اختلاف الدماغ البيئات تؤثر على مصير إينتيرنيورون والنضج، قمنا بتطوير بروتوكول لحصاد السلائف المسمى فلوريسسينتلي إينتيرنيورون غير ناضجة من مناطق محددة من الدماغ في الفئران حديثي الولادة (P0-P2). في هذا العصر، إينتيرنيورون الهجرة أوشك على الاكتمال ويقيمون هذه الخلايا في بيئاتها يستريح النهائي مع التكامل متشابك قليلاً نسبيا. عقب مجموعة من الحلول خلية واحدة فقط عن طريق التدفق الخلوي، هي زرع هذه السلائف إينتيرنيورون إلى P0-P2 wildtype الجراء بعد الولادة. قبل تنفيذ كل هوموتوبيك (مثلاً، قشرة إلى قشرة) أو هيتيروتوبيك (مثلاً، اللحاء إلى الحصين) عمليات الزرع، يمكن للمرء أن تقييم كيفية تحدي إينتيرنيورونس غير ناضجة في بيئات جديدة في الدماغ يؤثر على مصيرهم، والنضج، ودمج الدوائر. يمكن حصادها في الفئران الكبار العقول وجزيئي مع طائفة واسعة من التحليل بوستوك على الخلايا المطعمة، بما في ذلك المناعي، الكهربية والنسخي التنميط. ويوفر هذا النهج العام المحققون مع استراتيجية للاعتداء بيئات الدماغ مختلفة كيف يمكن التأثير على الجوانب العديدة للتنمية العصبية وتحديد ما إذا كانت الخصائص العصبية تدفعها أساسا البرامج الوراثية ماثلة أو منبهات بيئية.
Introduction
الوظيفة القشرية السليم يتطلب توازناً بين الإسقاط ضادات الخلايا العصبية والمثبطة جابايرجيك إينتيرنيورونس، سكان الغاية غير متجانسة مع مورفولوجيس متميزة، الخصائص الكهربية، والاتصال والكيميائية العصبية علامات. ارتبط وضع غير طبيعي ووظيفة إينتيرنيورونس (ومجموعات فرعية محددة إينتيرنيورون) بل اضطرابات نفسية مثل الفصام، التوحد والصرع1،،من23. وعلاوة على ذلك، العديد من الجينات المتورطين في هذه الاضطرابات الدماغ هي إثراء بقوة في إينتيرنيورونس الشباب4. وبالتالي، فهم أكبر للآليات التي تنظم تحديد مصير إينتيرنيورون والنضج ضروري لفهم التطور الطبيعي ومسببات محتملة للعديد من الأمراض في الدماغ.
إينتيرنيورونس forebrain يولدون أساسا من هذين الهيكلين الجنينية عابرة، الآنسي ووالذيليه امينينسيس جانجليونيك (MGE وفريق الخبراء الاستشاري، على التوالي). هذه الخلايا بوستميتوتيك (إينتيرنيورون السلائف) ثم الخضوع لمرحلة هجرة عرضية التي طال أمدها لتفريق في جميع أنحاء تيلينسيفالون حيث أنها الاندماج في مجموعة متنوعة واسعة من الدوائر. إينتيرنيورونس المستمدة من MGE تتألف من ثلاث مجموعات فرعية غير متداخلة إلى حد كبير، تعريف نيوروتشيميكالي: سريع التشويك بارفالبومين (PV+) إينتيرنيورونس، سريع-التشويك سوماتوستاتين (SST+) إينتيرنيورونس، والنتوءات أواخر العصبية النيتريك أكسيد إينتيرنيورونس synthase (ننوس+) التي تشكل الخلايا نيوروجليافورم واللبلاب هيبوكامبال. وحددت العديد من مختبرات عدة آليات داخل MGE التي تنظم قرارات مصير الأولية في PV+ أو درجة حرارة سطح البحر + إينتيرنيورونس، بما في ذلك التدرجات المكانية من مورفوجينس، وتاريخ الميلاد من السلائف إينتيرنيورون، ووضع شعبة العصبية 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10-وقد اقترح أن إينتيرنيورونس التفريق في بادئ الأمر إلى ‘فئات أساسية’ وثم تنضج تدريجيا إلى ‘فئات نهائي’ كما أنها تتفاعل مع هذه البيئة11. الأدلة الحديثة تشير إلى أن بعض الأنواع الفرعية إينتيرنيورون ناضجة قد يكون وراثيا ماثلة كما تصبح هذه الخلايا بوستميتوتيك في امينينسيس جانجليونيك، مشيراً إلى أن أوائل البرامج الوراثية الجوهرية المحددة قد تلعب دوراً أكبر من أي وقت سبق 13من تقدير12،. بيد أن المسألة الرئيسية المتعلقة بكيفية تفاعل البرامج الوراثية الأصيلة التي مع منبهات البيئية إلى التمايز بالسيارة إلى أنواع فرعية متميزة إينتيرنيورون لا تزال غير مستكشفة إلى حد كبير.
العديد من الدراسات قد زرع الخلايا الجنينية MGE مباشرة إلى مجموعة متنوعة من مناطق الدماغ، مع نتائج توافق الآراء المطعمة خلايا ناضجة، وإطلاق سراح غابا تمنع عموما في الدوائر المحلية الذاتية14،15، 16،17،،من1819. وهذه الملاحظات واعدة ولدت اهتماما كبيرا في استخدام الخلايا الجذعية البشرية المستحثة pluripotent (هيبسك)-مشتقة إينتيرنيورونس لعلاج مجموعة متنوعة من أمراض المخ. ومع ذلك، عدد قليل جداً من هذه الدراسات تقييم ما إذا كانت هذه الخلايا المطعمة الناضجة إلى الأنواع المتوقعة من إينتيرنيورونس ناضجة، عنصرا حاسما عندما يكون أحد يفكر في النهج المتعدية.
لمعالجة كيفية تأثير البيئة إينتيرنيورون التمايز والنضج، تم استنباط استراتيجية زرع السلائف إينتيرنيورون غير ناضجة في بيئات جديدة في الدماغ من أجل دراسة ما إذا كانت إينتيرنيورونس المطعمة اعتماد ميزات المضيفة البيئة أو الاحتفاظ بميزات من البيئة المانحة20. زرع MGE ليست مناسبة لمعالجة هذه المسألة MGE يحتوي على عدد سكان مختلطة من إينتيرنيورون وجابايرجيك إسقاط الخلايا التي تفريق في أنحاء عديدة من مناطق الدماغ21. دون أن يعرفوا أن هاجروا فيها هذه الخلايا MGE، واحد يمكن عدم إجراء تقييم كامل لكيف تتأثر عمليات الزرع هذه البيئة الدماغ. قبل الحصاد السلائف إينتيرنيورون في تيميبوينتس بعد الولادة المبكرة، هو الالتفاف حول هذه المشكلة عن طريق الحصول على خلايا غير ناضجة أن أكملوا هجرتهم والتوصل إلى هدفهم الدماغ المنطقة ولكن الحد الأدنى من التفاعل مع البيئة. من خلال التركيز على سمات محددة من إينتيرنيورونس التي يتم التعبير عنها متباين بين مناطق الدماغ متميزة، واحد ثم تحديد كيفية تغيير بيئة المضيف خصائص إينتيرنيورون. ينبغي أن يكون النهج العام المبين في هذا البروتوكول تنطبق على أي محقق أن يريد دراسة الخلايا العصبية الشباب كيف تتصرف عندما طعن في بيئة جديدة.
Protocol
Representative Results
Discussion
أحد الجوانب البالغة الأهمية في هذا البروتوكول هو تحقيق أقصى قدر من قابلية البقاء في الخلايا. كفالة أن الأنسجة والخلايا دائماً في الجليد الباردة كاربوكسيجيناتيد ساكسف أمر ضروري لتعزيز بقاء الخلية. وهذا يتطلب إجراء تشريح كفاءة وتفكك استراتيجية للتقليل من طول الفترة الزمنية التي تنفق الخل?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وأيده هذا البحث “المعاهد الوطنية للصحة” (K99MH104595)، وبرنامج البحوث الداخلية NICHD T.J.P. ونحن نشكر “فيصل غورد”، في المعمل الذي أنشئ أصلاً هذا النهج.
Materials
| Sodium chloride | Sigma | S7653 | |
| Sodium bicarbonate | Sigma | S6297 | |
| Potassium chloride | Sigma | P9541 | |
| Sodium phosphate monobasic | Sigma | S0751 | |
| Calcium chloride | Sigma | C5080 | |
| Magnesium chloride | Sigma | M2670 | |
| Glucose | Sigma | G7528 | |
| Sucrose | Sigma | S7903 | |
| Brain Matrices | Roboz | SA-2165 | Only needed if harvesting striatum |
| Fine point Dumont Forceps | Roboz | RS-4978 | |
| Microdissecting scissors | Roboz | RS-5940 | |
| Razor blades | ThermoFisher | 12-640 | |
| Pasteur pipettes | ThermoFisher | 1367820C | |
| Nanoject III | Drummond | 3-000-207 | |
| Manual Manipulator w/ stand | World Precision Instruments | M3301R/M10 | |
| 5 ml round bottom plastic tubes | ThermoFisher | 149591A | |
| 60 mm Petri dishes | ThermoFisher | 12556001 | |
| 100 mm Petri dishes | ThermoFisher | 12565100 | |
| Pronase | Sigma | 10165921001 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | ThermoFisher | 16140063 | |
| DNase I | Sigma | 4716728001 | |
| Celltrics 50um filters | Sysmex | 04-0042327 | |
| Trypan blue | ThermoFisher | 15-250-061 | |
| Hemocytometer | ThermoFisher | 02-671-6 |
Riferimenti
- Bozzi, Y., Casarosa, S., Caleo, M. Epilepsy as a neurodevelopmental disorder. Front Psychiatry. 3 (19), (2012).
- Takano, T. Interneuron Dysfunction in Syndromic Autism: Recent Advances. Dev Neurosci. , (2015).
- Inan, M., Petros, T. J., Anderson, S. A. Losing your inhibition: linking cortical GABAergic interneurons to schizophrenia. Neurobiol Dis. 53, 36-48 (2013).
- Batista-Brito, R., Machold, R., Klein, C., Fishell, G. Gene expression in cortical interneuron precursors is prescient of their mature function. Cereb Cortex. 18 (10), 2306-2317 (2008).
- Flames, N., et al. Delineation of multiple subpallial progenitor domains by the combinatorial expression of transcriptional codes. J Neurosci. 27 (36), 9682-9695 (2007).
- Wonders, C. P., et al. A spatial bias for the origins of interneuron subgroups within the medial ganglionic eminence. Dev Biol. 314 (1), 127-136 (2008).
- Inan, M., Welagen, J., Anderson, S. A. Spatial and temporal bias in the mitotic origins of somatostatin- and parvalbumin-expressing interneuron subgroups and the chandelier subtype in the medial ganglionic eminence. Cereb Cortex. 22 (4), 820-827 (2012).
- Petros, T. J., Bultje, R. S., Ross, M. E., Fishell, G., Anderson, S. A. Apical versus Basal Neurogenesis Directs Cortical Interneuron Subclass Fate. Cell Rep. 13 (6), 1090-1095 (2015).
- Taniguchi, H., Lu, J., Huang, Z. J. The spatial and temporal origin of chandelier cells in mouse neocortex. Science. 339 (6115), 70-74 (2013).
- Bandler, R. C., Mayer, C., Fishell, G. Cortical interneuron specification: the juncture of genes, time and geometry. Curr Opin Neurobiol. 42, 17-24 (2017).
- Kepecs, A., Fishell, G. Interneuron cell types are fit to function. Nature. 505 (7483), 318-326 (2014).
- Mayer, C., et al. Developmental diversification of cortical inhibitory interneurons. Nature. 555 (7697), 457-462 (2018).
- Mi, D., et al. Early emergence of cortical interneuron diversity in the mouse embryo. Science. 360 (6384), 81-85 (2018).
- Alvarez-Dolado, M., et al. Cortical inhibition modified by embryonic neural precursors grafted into the postnatal brain. J Neurosci. 26 (28), 7380-7389 (2006).
- Baraban, S. C., et al. Reduction of seizures by transplantation of cortical GABAergic interneuron precursors into Kv1.1 mutant mice. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (36), 15472-15477 (2009).
- De la Cruz, E., et al. Interneuron progenitors attenuate the power of acute focal ictal discharges. Neurotherapeutics. 8 (4), 763-773 (2011).
- Gilani, A. I., et al. Interneuron precursor transplants in adult hippocampus reverse psychosis-relevant features in a mouse model of hippocampal disinhibition. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (20), 7450-7455 (2014).
- Larimer, P., et al. Caudal Ganglionic Eminence Precursor Transplants Disperse and Integrate as Lineage-Specific Interneurons but Do Not Induce Cortical Plasticity. Cell Rep. 16 (5), 1391-1404 (2016).
- Martinez-Cerdeno, V., et al. Embryonic MGE precursor cells grafted into adult rat striatum integrate and ameliorate motor symptoms in 6-OHDA-lesioned rats. Cell Stem Cell. 6 (3), 238-250 (2010).
- Quattrocolo, G., Fishell, G., Petros, T. J. Heterotopic Transplantations Reveal Environmental Influences on Interneuron Diversity and Maturation. Cell Rep. 21 (3), 721-731 (2017).
- Xu, Q., Tam, M., Anderson, S. A. Fate mapping Nkx2.1-lineage cells in the mouse telencephalon. J Comp Neurol. 506 (1), 16-29 (2008).
- Thompson, L., Bjorklund, A. Survival, differentiation, and connectivity of ventral mesencephalic dopamine neurons following transplantation. Prog Brain Res. 200, 61-95 (2012).
- Liang, Y., Agren, L., Lyczek, A., Walczak, P., Bulte, J. W. Neural progenitor cell survival in mouse brain can be improved by co-transplantation of helper cells expressing bFGF under doxycycline control. Exp Neurol. 247, 73-79 (2013).
