Analyse de calcul de la lignée germinale de Caenorhabditis elegans pour étudier la Distribution des noyaux, les protéines et le cytosquelette
Summary
Nous présentons une méthode automatisée pour une reconstruction tridimensionnelle de la lignée germinale de Caenorhabditis elegans . Notre méthode détermine le nombre et la position de chacun des noyaux dans les cellules germinales et l’analyses germline PROTÉINE distribution et la structure du cytosquelette.
Abstract
La lignée germinale Caenorhabditis elegans (c. elegans) est utilisée pour étudier plusieurs processus biologiquement importants, y compris la dynamique de développement, l’apoptose et chromosomes cellules souches. Alors que la lignée germinale est un excellent modèle, l’analyse est souvent bidimensionnelle en raison de l’heure et la main-d’oeuvre requise pour l’analyse en trois dimensions. Grands afficheurs dans de telles études sont la nombre et la position des noyaux et la distribution des protéines au sein de la lignée germinale. Nous présentons ici une méthode pour exécuter une analyse automatisée de la lignée germinale, à l’aide de la microscopie confocale et approches informatiques pour déterminer le nombre et la position des noyaux dans chaque région de la lignée germinale. Notre méthode analyse également la distribution de protéines de cellules germinales qui permet l’examen en trois dimensions de l’expression de la protéine dans différents fonds génétiques. De plus, notre étude montre des variations dans l’architecture du cytosquelette dans des régions distinctes de la lignée germinale qui peut tenir compte des exigences spécifiques de développement spatiales. Enfin, notre méthode permet un comptage automatisé du sperme dans la spermathèque de chaque lignée germinale. Pris ensemble, notre méthode permet une analyse phénotypique rapide et reproductible de la lignée germinale de c. elegans .
Introduction
La conservation des voies avec mammifères de signalisation fait c. elegans , un excellent modèle pour étudier plusieurs processus biologiques1,2. Dans notre laboratoire, nous utilisons la lignée germinale de c. elegans pour étudier le développement de cellules souches, l’apoptose et l’expression des gènes. Alors que la lignée germinale est une structure tridimensionnelle, de nombreuses études sont deux dimensions étant donné la nature de longues et fastidieuse de l’analyse en trois dimensions. Il est fort probable que l’analyse bidimensionnelle peut fausser in vivo d’évenements dans la lignée germinale. L’hermaphrodite adulte de c. elegans a deux branches de la lignée germinale, dont chacune abrite une cellule somatique distale (DTC) qui maintient les cellules germinales distales dans l’État indifférencié3,4. Ces cellules germinales commencent à faire la différence car ils s’éloigner de la CRN, échapper à son influence et devenir des ovocytes et du sperme qu’ils atteignent l’extrémité proximale de la lignée germinale. Au cours de ce processus, les noyaux de cellules germinales subissent une mitose, avant de passer à la méiose5,6. La production de spermatozoïdes est complétée par le stade larvaire 4 (L4), la mise au point, après quoi les ovocytes sont produites au cours de l’âge adulte. Les spermatozoïdes sont stockés dans la spermathèque où ils féconder les ovocytes à produire des embryons.
Il y a plusieurs facteurs génétiques et environnementaux qui peuvent influencer le développement des cellules germinales chez c. elegans , entraînant des changements dans le nombre de noyaux, nombre d’événements apoptotiques, dynamique des chromosomes et expression de la protéine ou localisation7 ,8,9,10,11. L’analyse de ces événements nécessite l’identification de chaque étape de la différenciation basée sur la distribution et de la morphologie nucléaire. Afin d’analyser avec précision ces paramètres manuellement avec un grand échantillon est long et fastidieux. Pour contourner ces inconvénients et activez la cohérence de l’analyse, nous avons développé une méthode automatisée pour examen en trois dimensions de la lignée germinale de c. elegans pour compter les noyaux, distribution de noyaux, expression de la protéine et du cytosquelette structure. En combinant la microscopie confocale à rendu tridimensionnel, nous avons généré des paramètres de taille et de forme pour l’identification de chaque étape de la différenciation des cellules germinales. En outre, cette méthode permet de comptage des noyaux de cellules germinales et sperme plus marqué du nombre de chromosomes dans chaque ovocyte.
Une structure cruciale dans la lignée germinale est le cytosquelette, qui assure la stabilité de la lignée germinale compartiment, la cyclose sida et la protection de noyaux de cellules germinales12. Utilisant le calcul rendu, nous avons effectué une reconstruction tridimensionnelle du cytosquelette des cellules germinales et identifié les caractéristiques du cytosquelette distinctes au sein de la lignée germinale. Nous décrivons ici un protocole étape par étape pour illustrer comment calcul analyse combinée d’imagerie confocale permet analyse détaillée de la lignée germinale de c. elegans .
Nous proposons une méthode rapide pour l’analyse tridimensionnelle de c. elegans lignée germinale (Figure 1). Selon l’analyse en trois dimensions, il est possible d’étudier la distribution tridimensionnelle des noyaux des cellules germinales (Figure 2 et Figure 3), automatisée comptage des cellules (Figure 2), reconstruction du cytosquelette germinale ( Figure 3), distribution des protéines (Figure 4) et ayant marqué le nombre de chromosomes dans les ovocytes (Figure 5) et de sperme dans la spermathèque. La méthode ne permet un dosage simple et précis de la lignée germinale mais identifie des phénotypes physiologiquement pertinents.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ce protocole vise à améliorer la précision et réduire le temps nécessaire pour l’analyse de la lignée germinale. Après l’emballage standard germlines disséqués, un modèle tridimensionnel de noyaux de cellules germinales est préparé par calcul rendu. Tout en permettant l’observation de la distribution de noyaux de cellules germinales dans l’espace, rendu tridimensionnel calcule le nombre de noyaux à des régions spécifiques de la lignée germinale. L’aspect essentiel de notre méthode est une défi…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous remercions Monash Microimaging pour leur support technique. Certaines souches ont été fournis par le centre de génétique de Caenorhabditis , qui est financé par le NIH Bureau des programmes d’Infrastructure de recherche (P40 OD010440). Ce travail a été soutenu par une Université Monash biomédecine bourse de découverte, subvention de projet NHMRC (GNT1105374), NHMRC Senior Research Fellowship (GNT1137645) et de bourse innovation veski : 23 VIF à Roger Pocock.
Materials
| C. elegans strains: wild type (N2, Bristol), rnp-8(tm2435) I/hT2[bli-4(e937) let-?(q782) qIs48] (I;III), cpb-3(bt17) I, glp-1 (e2141) III | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | ||
| OP50 Escherichia coli bacteria | Homemade | ||
| Nematode Growth Media (NGM) plates | Homemade | ||
| polyclonal rabbit anti-REC-8 | SDIX | 29470002 | |
| Alexa 488 conjugated antibody raised in goat | Thermofisher Scientific | A-21236 | |
| Cytoskeletal dye phalloidin | Thermofisher Scientific | A-12380 | |
| DAPI | Thermofisher Scientific | 62248 | |
| Poly-L-lysine | Sigma Aldrich | P5899 | |
| Tetramisol | Sigma Aldrich | P5899 | |
| MgSO4 | Sigma Aldrich | M7506 | |
| 1M HEPES buffer, pH 7.4 | Sigma Aldrich | G0887 | |
| 10X PBS pH 7.4 | Thermofisher Scientific | AM9625 | |
| Tween-20 | Sigma Aldrich | P1389 | |
| EGTA | Sigma Aldrich | E3889 | |
| 37% Paraformaldehyde solution | Merck Millipore | 1040031000 | |
| Normal goat serum | Sigma Aldrich | G9023 | |
| Fluoroshield fixing reagent | Sigma Aldrich | F6182 | |
| Ethanol | Millipore | 1009832511 | |
| Methanol | Sigma Aldrich | 34860 | |
| 20°C & 25°CIncubator | Any brand | ||
| Light microscope | Any brand | ||
| Confocal microscope | Any brand (Leica, Zeiss) | ||
| Computer equipped with Imaris suit 8.4.1 or later version, full licence to use the software and Matlab software. | Bitplane | ||
| Phospho buffered saline, pH 7.4 | Homemade | ||
| Teflon microscope slides | Tekdon | 941-322-8288 |
Riferimenti
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