Создание первого поля как сердце сердца прародителями и кардиомиоцитов желудочков как от человеческих плюрипотентных стволовых клеток
Summary
Здесь мы описываем масштабируемый метод, используя простое сочетание Activin и Лентивирусы опосредованной Id1-гиперэкспрессия, для создания первого сердца поле как сердечная прародителями и кардиомиоцитов желудочков как из человеческих плюрипотентных стволовых клеток.
Abstract
Поколение большое количество функциональных человеческих плюрипотентных стволовых клеток, полученных сердца прародителями и кардиомиоцитов определенных сердце области происхождения является предварительным условием для терапии сердечной клетки и моделирование болезней. Недавно мы показали, что гены Id необходимых и достаточных для указания первого прародителями поля сердца во время развития позвоночных. Эта дифференциация протокол использует эти выводы и использует гиперэкспрессия Id1 в сочетании с Activin как мощным указание подсказки производить первый сердце поля как прародителями (FHF-L). Важно отметить, что результирующая прародителями эффективно дифференцироваться (~ 70 – 90%) в кардиомиоцитов желудочков как. Здесь мы описываем подробный метод 1) генерировать Id1 экспрессирующих hPSCs и 2) дифференцировать cryopreservable прародителями FHF-L и кардиомиоцитов желудочков как масштабируемые количествах.
Introduction
Крупномасштабное производство человеческих плюрипотентных стволовых клеток (hPSCs)-производных сердца прародителями и кардиомиоцитов является предпосылкой для основанного на стволовых клеток лечение1, болезни,2,3 и быстрое характеристика моделирования Роман пути регулирования сердца дифференциация4,5,6 и физиологии7,,8. Хотя ряд исследования9,10,,11,12,13,,14,15 ранее описал высокоэффективных сердца дифференциация протоколы от hPSCs, никто не обратился сердца поле происхождение результате кардиомиоцитов, несмотря на выявление существенных молекулярные различия между левой (первое поле сердца) и правый (второе сердце поле) кардиомиоцитов желудочков16 и существование врожденных пороков сердца сердце конкретного поля; то есть, гипоплазии левого желудочка синдром17 или аритмогенная дисплазия правого желудочка18. Таким образом, поколение сердечной прародителями и кардиомиоцитов определенных сердце области происхождения из hPSCs становится необходимостью для того, чтобы повысить их актуальность как терапевтические и болезни, инструменты моделирования.
Этот протокол основывается на учредительном гиперэкспрессия Id1, недавно выявленных5 первый сердце поле Указание подсказки, в сочетании с Activin, необходимыми и достаточными для возбуждения cardiogenesis в hPSCs. В частности, Каннингем и др. (2017) 5 показывают, что Id1-индуцированной прародителями специально Экспресс первое поле сердца (HCN4, TBX5), но не второй маркеры поля сердца (SIX2, ISL1), как они проходят сердца дифференциации. Кроме того авторы также показывают, что трансгенные мыши эмбрионы не хватает вся семья Id генов (Id1–4), без формирования первого сердце поля сердца прародителями, при более медиальной и задняя сердца прародителями ( Второе сердце поле) по-прежнему могут образовывать, тем самым предлагая, что белки Id необходимо начать первый сердце поля cardiogenesis в естественных условиях. Удобно, Id1-индуцированной прародителями может быть замораживают и спонтанно дифференцироваться в кардиомиоцитов, отображение желудочков подобные характеристики, включая выражение желудочков специфических маркеров (IRX4, MYL2) и желудочков как потенциалы действия.
Здесь мы опишем простой и масштабируемый метод для создания первого сердца поле как (FHF-L) сердечной прародителями и кардиомиоцитов желудочков как от Id1 избытком hPSCs. Важной особенностью этого протокола является возможность расцепить сердца прародитель поколения от последующих cardiomyocyte производства, используя удобный криоконсервирования шаг. Таким образом этот протокол детали необходимые шаги (1) генерировать Id1 экспрессирующих hPSCs, (2) создать сердца прародителями FHF-L от hPSCs, (3) криоконсервировать результате прародителями и (4) возобновить FHF-L сердца прародитель дифференциации и генерировать высокообогащенного (> 70 – 90%) избиение кардиомиоцитов желудочков как.
Protocol
Representative Results
Discussion
Для успешной дифференциации убедитесь, что внимательно следуйте инструкциям, перечисленным выше. Кроме того здесь мы выделить ключевые параметры, которые сильно влияют на дифференциации результатов. Перед началом дифференциация, должны соблюдаться следующие три морфологические пар?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы благодарим членов кола лаборатории для полезные обсуждения и критические обзоры рукописи. Это исследование было поддержано NIH/NIEHS R44ES023521-02 и CIRM диск2-10110 предоставляет доктора кола.
Materials
| ACTC1 antibody | Sigma | A7811 | |
| Activin A | Stem Cell Technologies | Hu Recom Activin A | |
| Antibiotic Antimycotic (Anti-Anti) | Thermo Fisher Scientific | 15240062 | |
| B27 supplement | Thermo Fisher Scientific | 17504044 | |
| B27 supplement w/o – insulin | Thermo Fisher Scientific | A1895601 | |
| B27 supplement w/o – vitamin A | Thermo Fisher Scientific | 12587001 | |
| CDH5 antibody | R&D Systems | AF938 | |
| CryoStor CS10 | Stem Cell Technologies | 7930 | Cryopreservation reagent |
| DMEM high Glucose | Mediatech | 10-013-CV | |
| DPBS w/ Ca & Mg | Corning | 21-030-CV | |
| EDTA | Thermo Fisher Scientific | 15575-038 | |
| FBS | VWR | 89510-186 | |
| FluoVolt membrane potential kit | Thermo Fisher Scientific | F10488 | For optical action potential acquisition, please refer to McKeithan et al. 2017 |
| KnockOut Serum Replacement | Gibco | 10828010 | |
| Matrigel, Growth Factor Reduced | Corning | 356231 | Coating reagent |
| mTeSR1 media kit | Stem Cell Technologies | 5850 | |
| PBS w/o Ca & Mg | Corning | 21-040-CV | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | ||
| Puromycin | Acros | 227422500 | |
| ReLeSR | Stem Cell Technologies | 5872 | Enzyme-free dissociation reagent |
| RPMI 1640 | Thermo Fisher Scientific | 11875-093 | |
| TAGLN antibody | Abcam | ab14106 | |
| Thiazovivin | Stem Cell Technologies | 72254 | RHO/ROCK pathway inhibitor |
| TrypLE Express | Thermo Fisher Scientific | 12605 -010 | 1X enzyme-containing dissociation reagent |
| Tyrodes solution mix packets | Sigma | T2145-10X1L | (For optical action potential acquisition, please refer to McKeithan et al. 2017) |
Riferimenti
- Chong, J. J., et al. Human embryonic-stem-cell-derived cardiomyocytes regenerate non-human primate hearts. Nature. 510, 273-277 (2014).
- Kodo, K., et al. iPSC-derived cardiomyocytes reveal abnormal TGF-beta signalling in left ventricular non-compaction cardiomyopathy. Nature cell biology. 18, 1031-1042 (2016).
- Kim, C., et al. Studying arrhythmogenic right ventricular dysplasia with patient-specific iPSCs. Nature. 494, 105-110 (2013).
- Colas, A. R., et al. Whole-genome microRNA screening identifies let-7 and mir-18 as regulators of germ layer formation during early embryogenesis. Genes & development. 26, 2567-2579 (2012).
- Cunningham, T. J., et al. Id genes are essential for early heart formation. Genes & development. , (2017).
- McKeithan, W. L., Colas, A. R., Bushway, P. J., Ray, S., Mercola, M. Serum-free generation of multipotent mesoderm (Kdr+) progenitor cells in mouse embryonic stem cells for functional genomics screening. Current protocols in stem cell biology. , 13 (2012).
- McKeithan, W. L., et al. An automated platform for assessment of congenital and drug-induced arrhythmia with hipsc-derived cardiomyocytes. Frontiers in physiology. 8, 766 (2017).
- Sharma, A., et al. High-throughput screening of tyrosine kinase inhibitor cardiotoxicity with human induced pluripotent stem cells. Science translational medicine. 9, (2017).
- Burridge, P. W., et al. Chemically defined generation of human cardiomyocytes. Nature methods. 11, 855-860 (2014).
- Kattman, S. J., et al. Stage-specific optimization of activin/nodal and BMP signaling promotes cardiac differentiation of mouse and human pluripotent stem cell lines. Cell stem cell. 8, 228-240 (2011).
- Laflamme, M. A., et al. Cardiomyocytes derived from human embryonic stem cells in pro-survival factors enhance function of infarcted rat hearts. Nature biotechnology. 25, 1015-1024 (2007).
- Lian, X., et al. Robust cardiomyocyte differentiation from human pluripotent stem cells via temporal modulation of canonical Wnt signaling. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109, 1848-1857 (2012).
- Willems, E., et al. Small molecule-mediated TGF-beta type II receptor degradation promotes cardiomyogenesis in embryonic stem cells. Cell stem cell. 11, 242-252 (2012).
- Yang, L., et al. Human cardiovascular progenitor cells develop from a KDR+ embryonic-stem-cell-derived population. Nature. 453, 524-528 (2008).
- Palpant, N. J., et al. Generating high-purity cardiac and endothelial derivatives from patterned mesoderm using human pluripotent stem cells. Nature protocols. 12, 15-31 (2017).
- DeLaughter, D. M., et al. Single-cell resolution of temporal gene expression during heart development. Developmental cell. 39, 480-490 (2016).
- Liu, X., et al. The complex genetics of hypoplastic left heart syndrome. Nature genetics. 49, 1152-1159 (2017).
- Corrado, D., Link, M. S., Calkins, H. Arrhythmogenic right ventricular cardiomyopathy. New England journal of medicine. 376, 1489-1490 (2017).
- Kitamura, T., et al. Retrovirus-mediated gene transfer and expression cloning: powerful tools in functional genomics. Experimental hematology. 31, 1007-1014 (2003).
