Hier beschrijven we een protocol waarmee histologische en moleculaire analyse van monsters van de huid na Candida albicans intradermale injectie. Dit protocol behoudt zijn de structurele integriteit van de huid en zorgt voor de lokalisatie van weefsel-ingezeten of nieuw aangeworven immune cellen, alsmede de verspreiding van de ziekteverwekker.
De huid is een zeer uitgebreide orgaan van het lichaam en, als gevolg van deze grote oppervlakte, het is voortdurend blootgesteld aan micro-organismen. Huid schade kan gemakkelijk leiden tot infecties in de dermis die kan, op hun beurt in de verspreiding van ziekteverwekkers in de bloedbaan resulteren. Inzicht in hoe het immuunsysteem vecht infecties in de zeer vroeg stadium en hoe de host kunt elimineren de ziekteverwekkers is een belangrijke stap om de basis voor toekomstige therapeutische interventies. Hier beschrijven we een model van Candida albicans infectie die de processen die zich tijdens een infectie voordoen, met inbegrip van wanneer het pathogene agens is verstreken, de epitheliale barrière, evenals de immune reactie ontlokte door de C. albicans vroeg kunt visualiseren invasie. We gebruikten deze infectie model histologische analyses die aantonen dat de immuuncellen die infiltreren in de huid, evenals de aanwezigheid en de lokalisatie van het pathogene agens uitvoeren. Monsters genomen nadat de infectie kan worden verwerkt voor RNA extractie.
Het menselijk lichaam is bedekt met een extreem hoog aantal micro-organismen. De oppervlakte van de huid is de habitat van bijna een miljoen bacteriën per vierkante centimeter1. Dit nummer, echter overeen niet met het volledige scala aan micro-organismen die de huid koloniseert. Naast bacteriën, is het menselijk lichaam gekoloniseerd door vele schimmel soorten, met inbegrip van C. albicans, die in staat zijn om te overleven op de mucosa en de huid niveau2is.
In de afgelopen jaren is het percentage van de mensen gediagnosticeerd met schimmelinfecties enorm toegenomen. Dat komt vooral door het hogere aantal immuungecompromitteerde personen, dat wil zeggen, HIV-positieve patiënten en patiënten die zijn gegaan door chemotherapie of Immunosuppressieve medicijnen na transplantatie3. In een surveillance studie, uitgevoerd in de Verenigde Staten, toonde Wisplinghoff et al. dat 9,5% van de nosocomiale bloedbaan infecties werden veroorzaakt door Candida soorten4. Als gevolg van het toegenomen voorkomen van schimmelinfecties, en met name vanwege het verhoogde percentage van Candida -soorten infecties van de bloedbaan geconstateerde, is begrijpen hoe deze ziekteverwekker ontsnapt aan de controle van het immuunsysteem zeer belangrijk.
C. albicans is een dimorphic schimmel die in verschillende morfologische vormen zoals gist, blastospores, pseudohyphae en schimmeldraden afhankelijk van de omgevingsomstandigheden5 groeit. In zijn hyphal vorm, C. albicans toont van zijn hoogste capaciteit van invasiviteit en heeft de mogelijkheid om te penetreren het epitheel6.
C. albicans infecties zijn bestudeerd met behulp van verschillende experimentele benaderingen. Het meest voorkomende model van infectie is de intraveneuze injectie van C. albicans gist7. Echter houdt dit model niet rekening alle processen die gebeuren voordat de schimmel beheert te verspreiden in de bloedbaan. Een ander model maakt gebruik van de mogelijkheid van C. albicans invasie van het epithelium. Deze methode, ook bekend als het schuurpapier model8, werd ontwikkeld door Gaspari et al. in 19989, en bestaat uit het gebruik van schuurpapier aan de huid, waardoor het stratum corneum alvorens C. albicansabrade. Deze procedure kan de schimmel te doordringen van het epitheel, waardoor de analyse van de invasieve capaciteiten van deze pathogenen. Tot slot, andere modellen van infecties voor de gastro-intestinale10 en11 van de luchtwegen zijn gebruikt in verschillende studies.
De vorming van een wond (zoals in het schuurpapier model) zorgt ervoor dat de activering van verschillende opleidingstrajecten, met inbegrip van immuun cel aanwerving en activering, teneinde het helende proces12. Dit kan veranderen of maskeren de immuunrespons specifiek ontlokte tegen de ziekteverwekker, waardoor verstorende resultaten.
Hier beschrijven we een methode van huidinfectie die eerste wond vorming vermijdt en de inductie van een basale inflammatoire omgeving. Als u wilt behouden de intact epitheliale structuur, injecteren we direct C. albicans in zijn hyphal vorm in de diepe derma. Hoewel een enkele injectie milde ontsteking uitlokken kan, het bedrag van de ontsteking is beperkt en beperkt in vergelijking tot de vorming van een open wond in de zand papieren model. De aanpak die we hier beschrijven maakt het mogelijk de studie van de immuunrespons voor schimmelinfectie en verspreiding terwijl het vermijden van de buitensporige en reeds bestaande inflammatoire omgeving veroorzaakt door mechanische schade.
Hier beschreven we een methode van C. albicans infectie te bestuderen van het inflammatoire proces dat wordt gestart bij de ingang van de schimmel in de diepe derma.
Hoewel huid abces formatie een relatief zeldzame gebeurtenis op C. albicans infectie15 is, kan injectie van de schimmel direct in de diepe derma niet alleen de studie van fungale gestuurde abces vorming, maar ook de analyse van specifieke immune cellen die deel uitmaken van bevatten schimm…
The authors have nothing to disclose.
FG wordt ondersteund door de Associazione Italiana per la Ricerca sul Cancro (IG 2016Id.18842), Cariplo Foundation (Grant 2014-0655) en Fondazione Regionale per la Ricerca Henelit (FRRB).
IZ wordt ondersteund door de NIH grant 1R01AI121066-01A1, 1R01DK115217, HDDC P30 DK034854 grant, Harvard Medical School Milton gevonden, CCFA Senior Research Awards (412708), de Eleanor en Miles Shore 50e verjaardag Fellowship-programma, en de Cariplo Foundation ( 2014-0859).
Reagents | |||
PBS | Euroclone | ECB4053L | warm in 37 °C bath before use |
H-OCT compound | histo-line laboratories | R0030 | |
Gill's Hematoxilyn | histo-line laboratories | 09-178-2 | |
Eosin Y solution, alcoholic | histo-line laboratories | 09-209-05 | |
Ethanol absolute | scharlau | ET00232500 | |
Citro-HISTOCLEAR | histo-line laboratories | R0050 | |
Eukitt, mounting medium | bio-optica | ||
Acetone | sigma-aldrich | 179124 | |
PAS staining system | sigma-aldrich | 395B-1KT | |
Bacto Peptone | BD | 211677 | |
Bacto Yeast Extract | BD | 212750 | |
D(+)-Glucose anhydrous for molecular biology | Applichem PanReac | 50-99-7 | |
Uridine | Merck Millipore | 8451 | |
HEPES | Applichem PanReac | A1070,0500 | |
Safe-Lock tubes 2 mL | eppendorf | 30121597 | |
TRIzol Reagent | Life Technologies | 15596018 | Toxic, corrosive and mutagen. Use all precaution needed |
Rneasy Mini Kit | QIAGEN | 74104 | |
liquid nitrogen | Wear eye protection | ||
Instrument | |||
Coulter Counter-Particle Count | Beckman Coulter | ||
Centrifuge 5415 R | eppendorf | ||
MC 3000 Microtome Cryostat | histo-line laboratories | ||
TissueLiser | QIAGEN | ||
Materials | |||
0.3 ml Insulin Syringe with a 30G x 8mm needle | BD | 324826 | |
Surgical forceps | |||
Surgical scissors | |||
Base mould disposable | histo-line laboratories | 2781 | |
Positively charged bio microscope slides | bio-optica | 09-2000 | |
Cover slips 24 x 50 mm | thermo scientific | 11911998 |