Medición de transporte de electrones membrana Trans-Plasma por C2C12 miotubos
Summary
El objetivo de este protocolo es espectrofotometría monitor plasma trans membrana transporte de electrones utilizando aceptadores del electrón extracelular y analizar las interacciones enzimáticas que pueden ocurrir con estos aceptadores del electrón extracelular.
Abstract
Transporte de electrones de la membrana trans-plasma (tPMET) desempeña un papel en la protección de las células del estrés reductor intracelular, así como protección contra el daño por oxidantes extracelulares. Este proceso de transporte de electrones de reductores intracelulares a extracelulares oxidantes no está bien definida. Aquí presentamos ensayos espectrofotométricos por C2C12 miotubos para monitorear tPMET utilizando los aceptadores del electrón extracelular: 1 sal de tetrazolio soluble en agua (WST-1) y 2, 6-dichlorophenolindophenol (DPIP o DCIP). A través de la reducción de estos aceptadores del electrón, que son capaces de controlar este proceso en un análisis en tiempo real. Con la adición de enzimas como la ascorbato oxidasa (AO) y superóxido dismutasa (SOD) para el análisis, podemos determinar que la porción de tPMET es debido a la producción de exportación o superóxido ascorbato, respectivamente. Mientras WST-1 fue demostrada para producir resultados estables con bajo fondo, DPIP pudo ser nuevamente oxidado después de la adición de la AO y césped, que se demostró con análisis espectrofotométrico. Este método demuestra un análisis espectrofotométrico en tiempo real, multi-bien, rápido con ventajas sobre otros métodos utilizados para controlar tPMET como ferricianuro (FeCN) y reducción c ferricytochrome.
Introduction
La capacidad de las membranas de plasma purificadas para reducir aceptadores del electrón ha llevado a la vista que la membrana plasmática tiene una capacidad inherente de redox de1. Visto previamente en hongos, plantas y animales, tPMET es un proceso común a múltiples organismos2,3,4,5. En concreto, este proceso ha sido demostrado en Saccharomyces cerevisiae, zanahoria células, eritrocitos, linfocitos, osteosarcoma, melanoma, macrófagos, músculo esquelético y neutrófilos2,3, 4 , 5 , 6 , 7. en un proceso que transporta electrones a través de la membrana de plasma para reducir oxidantes extracelulares, tPMET participa en muchas funciones celulares incluyendo: célula crecimiento5,8, de la viabilidad de la célula9, hierro metabolismo10,11,12,13y la protección de especies de oxígeno reactivo12,14,15de señalización de la célula. Debido a la implicación de tPMET en muchas funciones celulares, un desequilibrio de tPMET ha presumido para contribuir al desarrollo de algunas condiciones de salud graves, incluyendo cáncer16,17de las enfermedades cardiovasculares, metabólicos y síndrome18.
Hay varias formas para controlar a la transferencia de electrones a través de la membrana del plasma, pero es la técnica más ampliamente utilizada evaluar la reducción de los aceptores de electrones extracelular a través de análisis colorimétricos. Aceptadores del electrón extracelular comúnmente utilizados son las sales de tetrazolio, DPIP, FeCN y ferricytochrome c19,20. La sal de tetrazolio más comúnmente utilizado es una segunda generación sal conocida como WST-119. Este compuesto es más fácil de utilizar en el análisis colorimétricos en comparación a las sales de tetrazolio de primera generación debido a dos grupos sulfonato, que aumentan su solubilidad de agua21. WST-1, junto con el intermedio electrón aceptador 1-metoxi-phenazine methosulfate (mPMS), se reduce en eventos de transferencia de electrones solo dos. Esta reducción cambia la forma oxidada de color débil de WST-1 a un precipitado más intenso, amarillo20,22. WST-1 tiene un coeficiente de extinción molar alta de 37 x 103 M-1cm-1, conduce a un análisis alta sensibilidad21,22. DPIP también es utilizado como un aceptor de electrones extracelular para controlar tPMET. Se ha demostrado que puede reducirse extracellularly DPIP por tPMET sin la ayuda de aceptadores de electrones intermedios23,24. Debido a la ausencia de aceptadores del electrón intermedio, DPIP puede directamente electrones Pick-up de la membrana del plasma, a diferencia de WST-124. Similar a la DPIP, FeCN ha visto reducirse extracelularmente a ferrocianuro, tPMET sin la ayuda de aceptadores de electrones intermedios19,24. A diferencia de WST-1 y DPIP, FeCN tiene un coeficiente de extinción molar baja conduce a un menor análisis sensibilidad9. Otro aceptor de electrones extracelular utilizados para monitorear tPMET es ferricytochrome c. Similar a WST-1, ferricytochrome c reducción aumenta con el uso del aceptador del electrón intermedio, mPMS22. A diferencia de WST-1 sin embargo, el método c ferricytochrome es menos sensible debido a una alta formación y un coeficiente de extinción molar baja22.
Aquí presentamos un método para el análisis en tiempo real de tPMET a través de análisis espectrofotométricos. El método utilizado los aceptadores del electrón extracelular WST-1 y DPIP, pues ambos tienen un coeficiente de extinción molar alta mientras que siendo menos costosa en comparación con los otros comúnmente utilizados aceptadores del electrón extracelular como c ferricytochrome. Utilizamos phenazine methosulfate (PMS) en lugar de multiprocesamiento tienen una composición química similar y PMS es mucho menos costoso. mPMS es fotoquímicamente estable que es una característica importante de un kit comercial que necesita una larga vida útil. Sin embargo, hacemos PMS fresca para cada ensayo, por lo que la estabilidad no debe ser un problema. También presentamos un método para evaluar posibles interacciones enzimáticas (ver figura 1) entre el aceptador del electrón extracelulares y enzimas que pueden ser utilizadas para caracterizar el proceso de tPMET. En concreto, las enzimas AO y el césped puede ser utilizado determinan la parte de tPMET es debido al transporte de ascorbato o liberación de superóxido extracelular, dos métodos comunes para los electrones que se transportará a través de la membrana plasmática.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hemos presentado dos métodos para utilizar aceptadores del electrón extracelular, WST-1 y DPIP, en ensayos espectrofotométricos para controlar tPMET en miotubos C2C12. Con el crecimiento de líneas celulares en los procedimientos de cultivo estándar y un lector espectrofotómetro de placas, es posible monitorizar tPMET con estos aceptadores del electrón en un análisis simple de la microplaca. WST-1 reducción es reproducible de pozo a pozo dentro de un ensayo, pero existe variabilidad día a día. El día a día co…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nos gustaría agradecer a Thomas Bell, Lyn Mattathil, Mark Mannino y Neej Patel por su soporte técnico. Este trabajo fue financiado por concesión de servicio de salud pública de Estados Unidos R15DK102122 del Instituto Nacional de Diabetes y digestivo y enfermedades del riñón (NIDDK) a Jonathan Fisher. El contenido del manuscrito es responsabilidad exclusiva de los autores y no representan necesariamente la opinión oficial de la NIDDK o los institutos nacionales de salud.
Materials
| C2C12 myoblasts | American Type Culture Collection | CRL-1772 | |
| Dulbecco's modified eagle's medium – low glucose | Sigma | D6046 | |
| Fetal Plex animal serum complex | Gemini Bio-Products | 100-602 | |
| penicillin-streptomycin | Sigma | 516106 | |
| horse serum | Gibco Technologies | 16050-130 | |
| Dulbecco's phosphate buffered saline | Sigma | D8537 | |
| trypsin-EDTA | Sigma | T4049 | |
| 15 cm culture dishes | TPP | 93150 | |
| 96 well culture plates | TPP | 92096 | |
| 2-(4-Iodophenyl)-3-(4-nitrophenyl)-5-(2,4-disulfophenyl)-2H-tetrazolium Sodium Salt (WST-1) | Accela ChemBio Inc | SY016315 | |
| phenazine methosulfate | Sigma | P9625 | |
| L-ascorbic acid | Sigma | A5960 | |
| ascorbate oxidase | Sigma | A0157 | |
| superoxide dismutase | Sigma | S5395 | |
| 2,6-dichloroindophenol sodium salt | ICN Biomedicals | 215011825 | |
| D-(+)-glucose | Sigma | G7528 | |
| HEPES sodium salt | Sigma | H3784 | |
| sodium chloride | Sigma | S7653 | |
| potassium chloride | Fisher Scientific | BP366 | |
| magnesium sulfate heptahydrate | Sigma | M5921 | |
| calcium chloride dihydrate | Sigma | C7902 | |
| potassium phosphate | Fisher Scientific | BP363 | |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | Thermo Scientific | 23225 | |
| Powerwave X-I spectrophotometer | Biotek Insturments | discontinued | |
| Spectronic Genesys 5 Spectrophotometer | Thermo Scientific | 336001 | |
| PureGrade 96-well microplate, F-bottom, clear, untreated, non-sterile | MidSci | 781602 | |
| Iron (II) chloride tetrahydrate | Sigma | 220299 | |
| Iron (II) sulfate heptahydrate | Sigma | 215422 | |
| hypoxanthine | Sigma | H9636 | |
| xanthine oxidase | Sigma | X4500 | |
| Excel | Microsoft | ||
| R Studio | Rstudio | https://www.rstudio.com/products/rstudio/ | |
| KC4 | Biotek Insturments | discontinued |
Riferimenti
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