从土壤、根际和根 Endosphere 提取细菌群落数据的根菌群探析

植物相关的微生物由细菌、古菌、病毒、真菌和其他真核微生物组成的动态和复杂的微生物群落组成。除了它们在引起植物病害方面的良好研究作用外, 植物相关的微生物还可以通过提高对生物和非生命胁迫的耐受性, 促进养分供应, 并通过激素的生产。因此, 特殊的兴趣存在于与植物根系 endospheres、豆科和周围土壤相关联的分类。虽然有些微生物可以在实验室产生的培养基上隔离培养, 但许多人不能, 部分原因是它们可能依赖与其他微生物的共生关系, 生长非常缓慢, 或者需要在实验室环境中不能复制的条件。由于它绕过了耕种的需要, 而且相对便宜和高通量, 基于序列的环境和宿主相关微生物样本的系统发育分析已成为测定微生物群落的首选方法。组成。

不同的下一代测序平台¹提供的适当排序技术的选择取决于用户的需求, 其中包括: 所需的覆盖率、扩增子长度、预期的社区多样性, 以及排序错误率, 读长, 和每运行成本/megabase。另一个需要在基于扩增子的测序实验中考虑的变量是什么基因将被放大, 以及将使用什么引物。在设计或选择底漆时, 研究人员常常被迫在放大的普遍性和由此产生的 amplicons 所能实现的分类分辨率之间做出权衡。因此, 这些类型的研究往往选择了引物和标记, 有选择地针对微生物群的特定子集。对细菌群落组成的评估通常是通过对细菌 16S rRNA 基因^2、3的一个或多个高变区域进行排序而完成的。在本研究中, 我们描述了一个基于扩增子的测序协议, 它是针对 16S rRNA 基因的 500 bp V3-V4 区域而开发的, 它允许对细菌类群进行广泛的扩增, 同时也为区分不同的分类群。此外, 该协议可以很容易地适应使用其他底漆集, 如那些针对真菌的 ITS2 标志或 18S rRNA 亚单位的真核生物。

虽然其他方法, 如猎枪 metagenomics, metatranscriptomics 和单细胞测序, 提供其他优势, 包括解决微生物基因组和更直接测量社区功能, 这些技术通常更比此处描述的系统系统分析更昂贵和计算密集型⁴。此外, 在根样本上执行猎枪 metagenomics 和 metatranscriptomics 产生的读数占宿主植物基因组的百分比很大, 克服此限制的方法仍在开发中^5,6。

与任何实验平台一样, 基于扩增子的分析可以引入一些潜在的偏差, 在实验设计和数据分析过程中应该考虑到这一点。这些方法包括样本采集、DNA 提取、PCR 引物的选择以及如何进行库准备。不同的方法可以显著地影响生成的可用数据量, 也会阻碍研究结果的比较。例如, 去除根际细菌的方法⁷和使用不同的提取技术或选择 DNA 提取套件^8,9已被证明大大影响下游分析, 这导致不同的结论关于哪些微生物存在和他们的相对丰度。由于可以自定义基于扩增子的分析, 所以在研究中进行比较可能具有挑战性。地球微生物学项目建议, 研究复杂系统的研究人员, 如植物相关的微生物群将受益于标准化协议的发展, 作为一种手段, 以尽量减少因应用而引起的变异性研究^10、11之间的不同方法。在这里, 我们讨论了以上的许多主题, 并提出了适当的最佳做法的建议。

该协议展示了从高粱双色收集土壤、根际和根样本的过程, 并使用建立良好的 dna 隔离套件¹¹提取 dna。此外, 我们的协议还包括一个详细的扩增子排序工作流, 使用一个常用的 “通用” 平台来确定细菌群落的^结构12, 13, 14.在最近发表的关于18种单子叶植物物种的根、根际和相关土壤的研究中, 本议定书已得到验证, 用于广泛的植物寄主, 其中包括高粱双色、玉米、和小麦的¹⁵。该方法也得到了验证, 以用于其他标记基因, 这表明其成功地应用于研究的真菌 ITS2 标记基因在龙舌兰微生物组学^16,17和草莓微生物群¹⁸。