Всасывания блистер протокол для изучения человеческий Т-клеточный вспомнить ответы в естественных условиях

Эта рукопись описывает практические процедуры для изучения человеческой иммунной памяти ответы в естественных условиях, кожный антигена напомнить и ячейка урожай с помощью индукции всасывания волдыря. TST была использована в качестве примера внутрикожные антигена осаждения и вакцины БЦЖ отозвания. Наконец пример SB образец характеристика потока гранулярных и мультиплекс цитокина анализа была предоставлена, демонстрируя, что примерно треть SB клетки были антиген специфические полифункциональных Т-клетки памяти фенотипа эффекторные.

Важнейшие шаги настоящего Протокола включают в себя метод внутрикожного введения, всасывания блистер индукции и проколов блистер. Во-первых правильно внутрикожные осаждения требует квалифицированного персонала. Неправильный осаждения может привести к оптимальным результатам. PPD, как правило, хорошо известных и безопасной кожный антигена, но ее состав может варьироваться между производителями, ограничивая сопоставимости^13,20. Этот доклад содержит инструкции для один внутрикожного осаждения 2 ту и при необходимости два параллельных осаждения (2 x 2 Вт), которые могут потребовать дополнительных этические утверждения. Однако другие исследования использовали 10 Вт, которые повышают вероятность сильной кожи реакции^10,21. Во время этапа индукционная SB малых поэтапное увеличение отрицательного давления уменьшит риск кровотечений и блистер разрыва. Шансы загрязнения с эритроцитов и лейкоцитов из крови, как правило, низкий². Асептический Пункционным методом предотвращает контаминацию и избегая контакта между прокола иглой и полом кожного волдыря уменьшает примесей мусора или клетки кожи-резидентов. Однако некоторые исследователи предпочитают урожай SB жидкости путем применения скользящего давления в Проколотые блистер¹⁰. Это может быть необходимо прокол перегородки внутри блистер. Сама техника SB минимально инвазивной; свернутые SBs исцелить без рубцов и инфекции очень редки. ² однако, некоторой степени гиперпигментация может произойти и вероятно SB индукции следует избегать людей с историей коллоидных рубцов.

Технические ограничения включают в себя низкий ячейке урожайности и соответственно ограниченные возможности для долгосрочного хранения. Отношения между лейкоцитарной урожайности, клинической реакции TST, блистер размер и эритроцитов загрязнение было подробно описано в других разделах^2,10. В БЦЖ напомнить экспериментов представленные здесь (рис. 1) 50 000, подразумевая мелкомасштабных экспериментальных настройки, используя эти клетки, особенно если SBC изучали только¹⁵. Средний общая доходность от каждого блистер Однако конкретные населения Т-клеток в образце SB основном превышает то, что находится в пробах КСДОР в относительных и абсолютных клеток. В этом примере представлен на рисунке 2количество тройной позитивных PPD-специфических Т-клеток в образце 100000 клеток SB были более чем 2 x больше, чем число найденных в 1 x 10⁶ получения от тот же донор (данные не показаны). Визуального скоринга TST реакции является наиболее распространенных клинический метод для оценки памяти микобактерий туберкулеза . Следует отметить основной адаптивной иммунологической реакции не пик в то же время как клинические кожи реакции^2,21. Не все прививки БЦЖ или Mtb-облучаемых лиц будет развивать сильные TST реакции и стратегии для классификации и обработки проб из номера TST-ответчиков, а также существовавшие ранее микобактериальной сенсибилизация в исследуемой популяции, необходимо рассмотреть до начала пробу напомнить, с помощью этого метода. Кроме того в обоих SB выборки и визуальные скоринга, существует потенциал для теоретической уклоном в лица с ответами сокращение кожи из-за глобального или кожи, связанных с нарушениями иммунитета, как видно, например, ВИЧ инфекции и определенных возрастных групп^{2, 13,18,20}. Кроме того иммунологические повышение TST реакции с повторное тестирование является хорошо известна в^20,22. Однако фенотипы SB клеток остаются довольно постоянными при TSTs являются неоднократные¹⁰. Это наблюдение поддерживает роль SB вспоминают в продольных исследований сотовых иммунных реакций.

Для Т-клеток иммунологов SB отзыва позволяет урожай высокой долей антиген специфические клетки. Однако сроки SB для отбора проб из PPD-осаждения является критическим, как клеточного состава и цитокина микроокружения меняться с течением времени. В этом протоколе, пузыри были индуцированных 7-дневный пост вызов и изолированных клеток были главным образом эффекторных памяти CD4 + Т-клеток включая высокой доли клеток с одним выражением и ИФН γ, ФНО α, Ил-2. Эти наблюдения согласуются с предыдущих исследований, описывающих, как активация, пролиферации и дифференцировки Т-клеток происходит в PPD-загрунтовать кожи^2,15,21. Кинетические исследования SB в PPD-сенсибилизированных лиц предполагают, что очень раннего реагирования кожи является неспецифической; Однако, уже в течение первых дней после PPD-задача, ответ становится доминируют CD4 + Т-клеток (оба Центральной фенотипов памяти памяти и эффекторных были описаны) и, после 3 дней, ответ доминируют высокие доли PPD-конкретных цитокина производства CD4 + Т-клетки^2,8,10,15,21. Этот адаптивный цитокинового ответа остается обнаруживаемыми для более чем 2 недели^2,8,10,23. 7 день пост TST, по-видимому, наиболее оптимальный момент для коллекции цитокина производства памяти CD4 + Т-клетки². Однако другие моменты времени, конечно, возможно, соответствующие зависимости от антигена и ответ интерес. Следует отметить, в одном исследовании адаптивный ответ PPD сообщалось до пика немного раньше со снижением секреции провоспалительных цитокинов уже в пост TST 5 дней¹⁰.

SB жидкость содержит высокий уровень провоспалительных цитокинов и другие белки, показано, что представитель микроокружения кожи,^15,,²⁴. Кинетика исследования показали, что TNF-α и ИФН γ уровнях в SB жидкости пик после 3 дней во время пиковых уровней IL-2 после 7 дней^2,10, вероятно, отражая преобладание адаптационного реагирования на этой поздней стадии. Потому что SB клетки были активированные в естественных условиях, они демонстрируют высокий спонтанное цитокина выпуска, а также потенциал для конкретного выпуска после рестимуляции (рис. 3 и 4).

Этот доклад посвящен CD4 + Т-клеточного иммунитета. Как показали на рисунке 2действительно были большинство изолированные Т-клеток CD4 +, в то время как там были почти не CD8 + Т-клеток в всасывание блистер жидкости. Это согласуется с другими SB PPD-напомнить исследований низких пропорциях и уступает мигрирующих количество CD8 + Т-клеток, по сравнению с числом CD4 + T клетки^2,8,10,23. Дальнейшее характеристика вклада CD8 + бы предпочтительно; Однако это выходит за рамки настоящего доклада.

T-клетки являются важными для иммунного контроля Mtb; Однако было трудно определить надежный коррелируют защиты, отражено в адаптивной иммунной реакции от крови^25,26. Этот блокпост серьезно препятствует развитию новых ТБ вакцин, как в настоящее время нет альтернативы для больших и очень дорогостоящие эффективности испытаний²⁷. ТБ вакцины разработчики определяют иммуногенность вакцины путем оценки малых и временные изменения в популяциях Т-клеток конкретных вакцин в крови^28,29. Однако сомнительно, актуальна ли малую часть циркулирующих антиген специфические Т-клеток в крови (т.е., способный переход на сайт инфекции и представитель Т-клеток богатые микроокружения контроллинга МТБ) ^{27 , 30 , 31} .

Основываясь на предыдущих исследований и данных, представленных в настоящем документе, кожный напомнить модель SB представляет нереализованный потенциал для изучения конкретных вакцин Т-клеток. Не только модель позволяет напомнить вакцины ответ генерируется несколько десятилетий назад, он также позволяет оценки реальной памяти потенциал в ткани-контекст,^15,18,19,21. Роман, определенные тесты кожи, которые включают антигены также входят Субблок ТБ вакцин, предложить новые возможности для оценки вакцин, используя эту модель^28,32. Кроме того, транскриптомики анализа позволяют предположить, что клетки – опосредованным иммунный ответ генерируется в PPD-вызов коже похож на ответ в МТБ-инфицированных легких¹⁸.

В то время как удар биопсия кожи также позволяют на урожай клетки с поверхности кожи и обеспечивают пространственной информации, по сравнению с SB выборки, метод более инвазивных и требует обработки ферментативной или механик подготовить сингл клеточной суспензии³³. Измерение cytokines и ячейки маркеры являются сопоставимыми между двумя методами^2,10.

Метод всасывания блистер уже применяется во многих областях медицинских исследований помимо дерматологии, отдельно или в сочетании с задачей системного или местные кожи. Примеры включают в себя исследования сепсиса, вирус Эпштейна Барр связанные лимфопролиферативных заболеваний, диабетической невропатии, потребление эффекты глюкокортикоидов и человеческих испытаний, испытания терапевтических антител или модели для Т-клеток целевой терапии^{10 ,34,,3536,,3738}.

С терапевтической точки зрения, метод кожной напомнить SB предлагает уникальные преимущества для изучения Центральной Т-клеточной памяти потенциальных и -от обоих биологических и технической точки зрения кожа кажется представить соответствующие выборки отсек^{2, 15,18,19,21}. В частности по сравнению с традиционной, пассивных проб циркулирующих репликацию, SB кожный напомнить метод позволяет для изучения Т-клеток, которые доказали свою способность мигрировать из лимфатических узлов в ответ на их соответствующих антигена и завершить местных расширение и дифференциации в ткани конкретных в vivo контексте^15,18,19,21.

В заключение модель продемонстрировала, здесь может быть актуально для исследователей в области человеческого адаптивного иммунитета и Т-клеток таргетинга агентов (т.е., в вакцинологии или рак исследований инфекционных заболеваний). TST модель применяется в настоящем Протоколе является, конечно же, особое значение в области ТБ вакцинологии. Однако основная концепция этой модели весьма применима в других областях исследований.