인간 T 세포 회수 응답에서 Vivo에서 공부 하는 흡입 물집 프로토콜

이 원고는 인간의 면역 메모리 응답에서 vivo에서, 흡입 물집 유도 함으로써 피부 항 원 회수 및 셀 수확을 사용 하 여 연구에 대 한 실질적인 절차를 설명 합니다. TST 피부 항 원 증 착 및 BCG 백신 회수의 한 예로 사용 되었다. 마지막으로, SB 표본 특성 흐름 cytometric 및 멀티플렉스 cytokine 분석의 예를 제공, 이펙터 메모리 형의 항 원 특정 polyfunctional T-세포를 했다 SB 셀의 세 번째는 대략 시연 했다.

이 프로토콜의 중요 한 단계는 피부 주입, 흡입 물집 유도 기술과 물집 펑크 포함 됩니다. 첫째, 올바른 피부 증 착 훈련된 인원을 필요합니다. 잘못 된 증 착 차선의 결과 발생할 수 있습니다. PPD는 일반적으로 잘 알려진 하 고 안전한 피부 항, 하지만 그 구성 comparability^13,20제한 제조 업체 간의 다를 수 있습니다. 이 보고서는 2 TU의 단일 피부 증 착 및 필요에 따라 두 개의 병렬 증언 (2 x 2 TU), 추가 윤리적인 승인을 요구할 수 있습니다에 대 한 지침을 제공 합니다. 그러나, 다른 연구 사용 10 부 엉, 강한 피부 반응^10,21의 가능성을 증가 하는. SB 유도 단계에서 부정적인 압력에서 작은 stepwise 증가 출혈 및 물집 파열의 위험을 줄일 것입니다. 적혈구와 백혈구 혈 류에서 오염의 기회는 일반적으로 낮은². 무 균 바늘 기술 미생물 오염을 방지 하 고 파편 또는 거주 피부 세포의 불순물을 감소 펑크 바늘 및 피부 물집 바닥 사이의 접촉을 피하고. 그러나, 일부 연구 자들은 SB 액체 구멍이 물집¹⁰회전 압력을 적용 하 여 수확을 선호 합니다. 그것은 물집 내의 septa 펑크 필요할 수 있습니다. SB 기법 자체는 최소 침 습; 축소 된 SBs 흉터 없이 치료 하 고 감염 매우 드물다. ^{그러나 2} , 어느 정도의 hypo-착 색 발생할 수 있습니다 및 SB 유도 아마 콜 로이드 흉터의 역사를 가진 사람들에 피해 야 한다.

기술 한계는 낮은 총 셀 수율 및 장기 저장을 위한 따라서 제한 된 옵션을 포함합니다. 백혈구 수율, 임상 TST 응답, 물집 크기, 및 적혈구 오염 간의 관계 되었습니다 철저 하 게^2,10설명 되어. BCG 회수 실험에서 여기에 제시 된 (그림 1), 각 물집에서 평균 총 수익률 50000, Sbc는¹⁵공부 혼자 하는 경우에 특히 이러한 세포를 사용 하 여 소규모 실험 설정을 암시 했다. 그러나, SB 샘플에서 특정 T 세포 인구 대부분 초과 두 상대 및 절대 셀 카운트에서 PBMC 샘플에서 무엇을 발견 합니다. 그림 2에 표시 하는 예제에서 트리플-긍정적인 PPD 전용 T-셀 100000 SB 세포의 샘플 수는 숫자에서 1 x 10⁶ PBMCs 같은 기증자 (데이터 표시 되지 않음)에서 보다 큰 x 2 이상 했다. TST 반응은 시각적으로 채 점 하는 것은 M. 결핵 메모리 평가 대 한 가장 일반적인 임상 방법입니다. 메모의 기본 적응 면역 반응 임상 피부 반응^2,21로 동시에 피크 하지 않습니다. 모든 BCG-예방 접종을 하지 또는 Mtb-노출된 개인 강한 TST 반응 및 분류, 그리고 응답자, TST 비-연구 인구에 기존 mycobacterial sensitization에서 샘플의 처리에 대 한 전략을 개발할 것입니다 이 메서드를 사용 하 여 리콜 재판을 시작 하기 전에 고려 될 필요가 있다. 또한, SB 샘플링 및 시각적 득점, 이론적인 편견 감소 피부 반응 때문에 글로벌 개인에 대 한 가능성 또는 본, 예를 들어, 특정 연령 그룹^{2, HIV 감염에 면역 장애 피부 관련 13,,1820}. 또한, 반복 테스트와 TST 반응의 면역 증폭 잘 알려진^20,22입니다. 그러나, TSTs는 반복된¹⁰SB 셀 고기 오히려 지속적인 유지 됩니다. 이 관찰 세포 면역 반응의 경도 연구에서 SB 회수의 역할을 지원합니다.

T-셀 immunologists, SB 회 항 원 특정 셀의 높은 분수의 수확 할 수 있습니다. 그러나, PPD 증 착에서 샘플링 SB의 타이밍은 세포 구성과 cytokine microenvironment 시간이 지남에 변경 중요 합니다. 이 프로토콜에서 물집 있었다 유도 7 일 후 도전과 고립 된 세포 주로 CD4 + 이펙터 메모리 T-세포 IFN-γ, TNF-α와 일리노이-2의 공동 식 셀의 높은 분수를 포함 하 여. 이 관측은 T-세포 활성화, 확산, 그리고 차별화 준비 하는 PPD 피부^2,,1521에서 발생 하는 방법을 설명 하는 이전 연구에 맞춰. PPD 응 개인 운동 SB 연구 제안 초기 피부 반응입니다. 그러나, 이미 일 내에 첫 번째 PPD 도전 다음, 응답 CD4 + T 세포 (둘 다 중앙 메모리와 이펙터 메모리 고기 설명 되었습니다)에 의해 지배 되 고, 3 일 후, 응답의 높은 분수에 의해 지배 된다 PPD 관련 cytokine 생산 하는 CD4 + T 세포^2,,810,,1521. 이 적응형 cytokine 응답 2 주^2,,810,23이상 감지 남아 있습니다. 7 일 게시물 TST 메모리 CD4 + T 세포²를 생산 하는 사이토카인의 컬렉션에 대 한 가장 최적의 시간 지점에 것 처럼 보인다. 그러나, 다른 시간 점 물론, 항 원 및 관심의 응답에 따라 관련성이 있을 수 있습니다. 노트, 한 연구에 적합 한 PPD 반응 5 일 포스트 TST¹⁰에 이미 프로-염증 성 cytokine 분 비 감소와 조금 일찍 절정에 보고 되었습니다.

SB 액체 프로 염증 성 cytokines과 피부 microenvironment^15,24의 대표자를 표시 하는 다른 단백질의 높은 수준을 포함 합니다. 활동 연구는 TNF-α와 IFN-γ 레벨 SB 유체 피크에 일리노이-2 레벨 피크 동안 3 일 후 7 일^2,10, 후 아마 반영 하는 적응형 응답의 지배력이 나중 단계에서 나타났습니다. 때문에 SB 세포 활성화 vivo에서, 그들은 높은 자발적인 cytokine 방출으로 restimulation (그림 3 및 4)에 따라 특정 릴리스에 대 한 잠재력을 전시.

이 보고서는 CD4 + T 세포 면역에 주력합니다. 그림 2에서 설명 된, 격리 된 T-세포의 대부분은 실제로 CD4 +, 동안 있었다 거의 아무 CD8 + T-세포는 흡입에 물집이 액체. 이 낮은 비율 및 CD8 + T 세포 CD4 + T 세포^2,8,,1023에 비해 열 등 한 철새 용량 보고 다른 SB PPD 리콜 연구 라인. CD8 + 기여의 더 특성 더 좋을 것 이다; 그러나,이이 보고서의 범위를 벗어납니다.

T-세포는 Mtb;의 면역 제어에 대 한 필수적인 것으로 간주 그러나, 그것은 혈액^25,26에서 적합 한 면역 반응에 반영 하는 보호의 믿을 수 있는 상관을 식별 하기 위해 어렵게 되었습니다. 이 바리 케이트로 현재 크고 매우 비용이 많이 드는 효능 실험²⁷대안이 새로운 결핵 백신의 개발을 심각 하 게 방해. 결핵 백신 개발자는 백신 immunogenicity 혈액^28,29에 백신 관련 T 세포 인구에 있는 작은, 일시적인 변화를 평가 하 여 결정 합니다. 그러나, 그것은 의심 항 원 특정 T-세포는 혈액에 순환의 작은 분수 관련 인지 (즉, 감염 및 T-세포-풍부한 microenvironment 제어의 대표 사이트로 마이그레이션 가능 Mtb) ^{27 , 30 , 31} .

이전 연구와 여기에 소개 하는 데이터를 바탕으로, SB 피부 리콜 모델 백신 관련 T-세포의 연구에 대 한 미 개발된 잠재력을 나타냅니다. 뿐만 아니라 않는 모델 사용 전 백신 생성 된 응답 수십 회, 그것은 또한 조직 관련 컨텍스트^15,18,,1921에 잠재적인 실제 메모리의 평가 있습니다. 소설, 특정 피부 테스트 후보 소 단위 결핵 백신의 구성 또한 항을 포함 하는이 모델^28,32를 사용 하 여 백신 평가 위한 새로운 기회를 제안 합니다. 또한, transcriptomic 분석 PPD 도전 피부에 생성 된 셀-중재 면역 응답은 유사 Mtb에 응답 제안-폐¹⁸감염.

피부 펀치 생체 검사는 피부에서 세포 수확에 대 한 허용 하 고 SB 샘플링에 비해 공간 정보를 제공 하는 동안 메서드를 사용 하면 더 많은 침략 및 효소 또는 기계 처리 단일 셀 정지³³준비 필요. Cytokines 및 셀 마커의 측정 두 가지 방법^2,10사이 비교할 수 있습니다.

흡입 물집 방법 단독으로 또는 함께 조직 또는 지역 피부 도전 외에 피부과, 의료 연구의 많은 분야에서 적용 된 이미. 예로 패 혈 증, 엡 스타인-바 바이러스 관련 lymphoproliferative 질병, 당뇨병 신경 병, glucocorticoid 섭취 효과 및 치료 항 체 또는 T-세포 타겟 요법^{10 모델을 테스트 하는 인체 실험의 연구 ,3435,36,,3738}.

치료 관점에서 SB 피부 리콜 방법 이점이 독특한 잠재적인 중앙 T-셀 메모리를 공부 하 고-의 관점-스킨 제공 관련 샘플링 구획^{2, 것 두 생물에서 및 기술 15,18,,1921}. 특히, PBMCs 순환의 전통, 수동 샘플링에 비해, SB 피부 리콜 메서드를 수 있습니다 로컬을 완료 하 고 그들의 관련 항 원에 대 한 응답에서 림프절에서 마이그레이션할 능력 입증 된 T-세포의 연구에 대 한 확장 그리고 vivo에서 조직 관련 컨텍스트^15,18,,1921에서 차별화.

결론적으로, 모델 여기 분야 내에서의 인간의 적응 면역과 T-셀 대상 에이전트 (즉, 전염병 백신 또는 암 연구에서) 연구자에 대 한 관련 될 수 있는 시연. TST 모델이이 프로토콜에 적용 되는, 물론, 결핵 백신 분야에 특별 한 관련성 의입니다. 그러나,이 모델의 기본적인 개념 연구의 다른 분야에도 적용 됩니다.