Un rápido y fácil tubería para generar genómica punto mutantes de C. elegans utilizando CRISPR/Cas9 ribonucleoproteínas
Summary
Aquí, presentamos un método para diseñar el genoma de C. elegans utilizando ribonucleoproteínas Cas9 CRISPR y plantillas de reparación dependiente de homología.
Abstract
Las repeticiones palindrómico intercaladas regularmente agrupadas (CRISPR) – CRISPR – asociaron proteína 9 (Cas9) sistema de defensa inmune adaptante procariotas ha sido cooptado como una poderosa herramienta para la ingeniería del genoma eucariota precisa. Aquí, presentamos un método rápido y sencillo usando RNAs quiméricos guía sola (sgRNA) y CRISPR Cas9 ribonucleoproteínas (RNPs) para la generación eficiente y precisa de genómicas mutaciones de punto en C. elegans. Describimos una tubería sgRNA selección de objetivos, diseño de plantilla de reparación dirigido por homología (HDR), secuestrantes de CRISPR Cas9 de RNP, entrega y una estrategia de genotipificación que permite la identificación rápida y robusta de animales correctamente editados. Nuestro enfoque no sólo permite el fácil generación y la identificación del punto deseado de genomic de animales mutantes, sino que también facilita la detección de otros alelos del complejo indel en aproximadamente 4-5 días con alta eficiencia y una proyección reducida carga de trabajo.
Introduction
Recientes avances tecnológicos han transformado radicalmente y acelera la capacidad de genomas de Ingeniero precisamente. En particular, el sistema CRISPR Cas9, que depende de la endonucleasa de RNA-dirigida Cas9 para inducir una rotura de doble cadena (DSB) cerca de la secuencia de destino de interés, se ha utilizado extensivamente para diseñar con precisión el genoma de la mayoría de organismos modelo utilizados en investigación biomédica1,2,3,4. Significativamente, el uso de CRISPR Cas9 ha desbloqueado la edición del genoma en especies difíciles como C. elegans5. Independientemente de la especie, generando mutaciones puntuales con el genoma de CRISPR-Cas9 basado en sistema de edición se basa en tres componentes básicos: 1) Cas9 endonucleasa, 2) un guía única RNA (sgRNA) que dirige la endonucleasa Cas9 para una secuencia de destino y 3) un usuario diseñado plantilla de reparación dirigido por homología (HDR) que contiene la edit(s) de interés2.
Hay varios métodos que pueden utilizar para introducir la segmentación sgRNA e Cas9 nucleasa en células como plásmido, RNA y entrega viral basado en métodos6. Recientemente, entrega directa de pre-complexed sgRNA-Cas9 ribonucleoproteínas (RNPs) ha emergido como una herramienta potente y eficaz en el genoma basado en el Cas9 CRISPR edición7. La entrega directa de pre-complexed CRISPR Cas9 RNPs tiene varias ventajas, a saber: 1) RNPs omitir la necesidad de transcripción celular y traducción 2) RNPs se eliminan rápidamente, que puede aumentar la especificidad al reducir el tiempo disponible para objetivo escote y 3) RNPs no contienen ninguna elementos extranjeros de ADN/ARN que evita la introducción de secuencias de no nativos en el genoma del anfitrión a través de la integración al azar. En conjunto, estos atributos probablemente proporcionan una breve ráfaga de objetivos CRISPR edición minimizando efectos off-target.
Se describe un protocolo sencillo y eficaz para introducir cambios genomic específico en C. elegans. Este protocolo incluye la focalización sgRNA y diseño de plantillas de informe único oligonucleótido trenzado (ssODN), secuestrantes de RNP sgRNA Cas9 y entrega y una estrategia de genotipación para la identificación inequívoca de los animales debidamente editados. Usando esta estrategia, no sólo pueden recuperar los cambios específicos del sitio que desee, pero otras mutaciones indel no específicos pueden también ser recuperados. Por lo tanto, nuestra estrategia permite la generación de una serie alélica mediante una estrategia única, donde mono-alélica, bi-alélicos y indel mutantes pueden generarse en la generación de1 F.
Protocol
Representative Results
Discussion
El sistema CRISPR Cas9 es una herramienta potente y eficaz para modificar precisamente el genoma de organismos modelo. Aquí, demostramos que eso quimérico sgRNAs20 junto con ssODN HDR plantillas permiten la generación altamente eficiente de genómicas mutaciones de punto en C. elegans. Importante aún, demostramos que entrega RNP produce alto rendimiento edición cuando la fluorescencia se utiliza como un marcador de selección Co, destacando la facilidad y la fiabilidad de la técnica…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Hay no hay conflictos de intereses relacionados con este informe.
Materials
| CRISPRevolution sgRNA EZ Kit | Synthego Inc. | chimeric sgRNA | |
| Nuclease-free TE | Synthego Inc. | provided with the sgRNA kit EZ kit | |
| Nuclease-free water | Synthego Inc. | provided with the sgRNA kit EZ kit | |
| 4 nmole Ultramer DNA Oligo | Integrated DNA Technologies | ssODN HDR template | |
| Alt-R S.p. HiFi Cas9 Nuclease 3NLS | Integrated DNA Technologies | 1078728 | Cas9 protein |
| pCFJ90 | Addgene | 19327 | Pmyo-2::mCherry Marker Plasmid |
| KCl | Sigma | P5405 | |
| HEPES | Sigma | H4034 | |
| DNA Clean & Concentrator | Zymo Research | D4004 | |
| Zymoclean Gel DNA Recovery Kit | Zymo Research | D4002 | |
| Q5 Hot Start High-Fidelity 2X Master Mix | New England Biolabs | M0494L | |
| Proteinase K | Sigma | P2308 | |
| Glass Borosilicate Glass Micropipettes | Sutter Instruments | BF100-78-10 | OD: 1.0mm. ID: 0.78mm |
| Trizma Hydrochloride | Sigma | T5941 | |
| MgCl2 | Sigma | M2393 | |
| NP-40 | Sigma | 74385 | |
| Tween-20 | Fisher Scientific | BP337-100 | |
| RNaseZap Decontamination Solution | Fisher Scientific | AM9780 |
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