Быстрое и поверхностным трубопровода для генерации геномной мутантов точки в C. elegans с помощью ТРИФОСФАТЫ/Cas9 Ribonucleoproteins
Summary
Здесь мы представляем метод инженер генома C. elegans используя ТРИФОСФАТЫ-Cas9 ribonucleoproteins и гомологии зависимых ремонт шаблоны.
Abstract
Кластерный повторяется регулярно перемежаются рецидивирующий (ТРИФОСФАТЫ) – ТРИФОСФАТЫ – связанных белков прокариот адаптивной иммунной обороны системы был кооптирован как мощный инструмент для точного генома эукариот техники 9 (Cas9). Здесь мы представляем быстрый и простой метод, используя химерных одно руководство РНК (sgRNA) и ТРИФОСФАТЫ-Cas9 Ribonucleoproteins (RNPs) для эффективного и точного поколения геномной точечные мутации в C. elegans. Мы описываем трубопровода для sgRNA выбор цели, ориентированные на гомологии ремонт (HDR) шаблон дизайна, ТРИФОСФАТЫ-Cas9-RNP комплексообразования и доставки и генотипирования стратегия, которая обеспечивает надежное и быстрое выявление правильно отредактированный животных. Наш подход не только позволяет легким поколение и определение желаемого геномной точки мутанта животных, но также облегчает обнаружение других сложных indel аллелей в приблизительно 4-5 дней с высокой эффективностью и снижение скрининг рабочей нагрузки.
Introduction
Последние технологические достижения радикально преобразована и ускоренного способность точно инженер геномов. В частности ТРИФОСФАТЫ-Cas9 система, которая опирается на РНК руководствуясь эндонуклеазы Cas9 вызвать разрыв двойной нити (DSB) вблизи последовательности целевых объектов, представляющих интерес, широко используется для точного инженер геном большинства модельных организмов, используемых в биомедицинских исследований1,2,3,4. Существенно использование ТРИФОСФАТЫ-Cas9 разблокирована, даже в трудных видов как C. elegans5изменения генома. Независимо от вида, генерации точечные мутации с геном основанный ТРИФОСФАТЫ-Cas9, редактирования системы основывается на трех основных компонентов: 1) Cas9 эндонуклеазы, 2) одно руководство РНК (sgRNA), который руководит Cas9 эндонуклеазы в последовательности целевых объектов и 3) разработан пользователем ориентированные на гомологии ремонт (HDR) шаблон, содержащий нужную edit(s) интерес2.
Существует несколько методов, которые можно использовать для нацеливания sgRNA и Cas9 Нуклеаза в клетки, включая плазмида, РНК и доставки на основе вирусные методы6. Недавно прямые поставки pre-complexed sgRNA-Cas9 Ribonucleoproteins (RNPs) стала мощным и эффективным инструментом в геноме ТРИФОСФАТЫ-Cas9 основе редактирования7. Прямая доставка pre-complexed ТРИФОСФАТЫ-Cas9 RNPs имеет несколько различных преимуществ, а именно: 1) RNPs обойти необходимость клеточной транскрипции и быстро очищаются перевод, 2) RNPs, которые могут повысить специфика путем уменьшения свободного времени для пробить расщепления и 3) RNPs содержат не иностранные элементы ДНК/РНК, которые нарушают введение неместных последовательностей в геном хоста через случайные интеграции. Вместе эти атрибуты вероятно обеспечивают недолго взрыв на цель ТРИФОСФАТЫ редактирования при сведении к минимуму эффекты пробить.
Мы опишем простой и эффективный протокол для конкретных участков геномных изменений в C. elegans. Этот протокол включает в себя ориентации sgRNA и одного мель олигонуклеотида (ssODN) HDR шаблон дизайна, sgRNA-Cas9 RNP комплексообразования и доставки и генотипирования стратегию для однозначной идентификации должным образом редактировать животных. Используя эту стратегию, не только может быть восстановлена желаемых конкретных изменений, но также могут быть взысканы другие неспецифические indel мутации. Таким образом наша стратегия позволяет поколение аллельные серии, используя единую стратегию, где моно аллельные, Би аллельных и indel мутанты могут создаваться в поколении1 F.
Protocol
Representative Results
Discussion
ТРИФОСФАТЫ-Cas9 система является мощным и эффективным инструментом для точного изменения генома модельных организмов. Здесь мы демонстрируем, что химерных sgRNAs20 в сочетании с ssODN HDR шаблоны включить высокоэффективных поколения геномной точечные мутации в C. elegans. Важно о?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Существует без конфликтов интересов, связанных к настоящему докладу.
Materials
| CRISPRevolution sgRNA EZ Kit | Synthego Inc. | chimeric sgRNA | |
| Nuclease-free TE | Synthego Inc. | provided with the sgRNA kit EZ kit | |
| Nuclease-free water | Synthego Inc. | provided with the sgRNA kit EZ kit | |
| 4 nmole Ultramer DNA Oligo | Integrated DNA Technologies | ssODN HDR template | |
| Alt-R S.p. HiFi Cas9 Nuclease 3NLS | Integrated DNA Technologies | 1078728 | Cas9 protein |
| pCFJ90 | Addgene | 19327 | Pmyo-2::mCherry Marker Plasmid |
| KCl | Sigma | P5405 | |
| HEPES | Sigma | H4034 | |
| DNA Clean & Concentrator | Zymo Research | D4004 | |
| Zymoclean Gel DNA Recovery Kit | Zymo Research | D4002 | |
| Q5 Hot Start High-Fidelity 2X Master Mix | New England Biolabs | M0494L | |
| Proteinase K | Sigma | P2308 | |
| Glass Borosilicate Glass Micropipettes | Sutter Instruments | BF100-78-10 | OD: 1.0mm. ID: 0.78mm |
| Trizma Hydrochloride | Sigma | T5941 | |
| MgCl2 | Sigma | M2393 | |
| NP-40 | Sigma | 74385 | |
| Tween-20 | Fisher Scientific | BP337-100 | |
| RNaseZap Decontamination Solution | Fisher Scientific | AM9780 |
Riferimenti
- Dickinson, D. J., Goldstein, B. CRISPR-Based Methods for Caenorhabditis elegans Genome Engineering. Genetica. 202, 885-901 (2016).
- Doudna, J. A., Charpentier, E. Genome editing. The new frontier of genome engineering with CRISPR-Cas9. Science. 346, 1258096 (2014).
- Ma, D., Liu, F. Genome Editing and Its Applications in Model Organisms. Genomics Proteomics Bioinformatics. 13, 336-344 (2015).
- Sander, J. D., Joung, J. K. CRISPR-Cas systems for editing, regulating and targeting genomes. Nat Biotechnol. 32, 347-355 (2014).
- Kim, H. M., Colaiacovo, M. P. CRISPR-Cas9-Guided Genome Engineering in C. elegans. Curr Protoc Mol Biol. 115, 31-31 (2016).
- Yin, H., Kauffman, K. J., Anderson, D. G. Delivery technologies for genome editing. Nat Rev Drug Discov. 16, 387-399 (2017).
- Kim, S., Kim, D., Cho, S. W., Kim, J., Kim, J. S. Highly efficient RNA-guided genome editing in human cells via delivery of purified Cas9 ribonucleoproteins. Genome Res. 24, 1012-1019 (2014).
- Haeussler, M., et al. Evaluation of off-target and on-target scoring algorithms and integration into the guide RNA selection tool CRISPOR. Genome Biol. 17, 148 (2016).
- Paix, A., Folkmann, A., Seydoux, G. Precision genome editing using CRISPR-Cas9 and linear repair templates in C. elegans. Methods. , (2017).
- Prior, H., Jawad, A. K., MacConnachie, L., Beg, A. A. Highly Efficient, Rapid and Co-CRISPR-Independent Genome Editing in Caenorhabditis elegans. G3 (Bethesda). 7, 3693-3698 (2017).
- JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. PCR: The Polymerase Chain Reaction. J Vis Exp. , (2017).
- Berkowitz, L. A., Knight, A. L., Caldwell, G. A., Caldwell, K. A. Generation of stable transgenic C. elegans using microinjection. J Vis Exp. , (2008).
- JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Restriction Enzyme Digests. J Vis Exp. , (2017).
- JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. DNA Gel Electrophoresis . J Vis Exp. , (2017).
- JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Gel Purification. J Vis Exp. , (2017).
- Estrada-Rivadeneyra, D. Sanger sequencing. FEBS J. , (2017).
- Ludolph, A. C., Brettschneider, J., Weishaupt, J. H. Amyotrophic lateral sclerosis. Curr Opin Neurol. 25, 530-535 (2012).
- Evans, T. C. . WormBook. , (2006).
- Mello, C. C., Kramer, J. M., Stinchcomb, D., Ambros, V. Efficient gene transfer in C.elegans: extrachromosomal maintenance and integration of transforming sequences. EMBO J. 10, 3959-3970 (1991).
- Jinek, M., et al. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337, 816-821 (2012).
- Boyd, S. D., et al. A Balanced Look at the Implications of Genomic (and Other "Omics") Testing for Disease Diagnosis and Clinical Care. Genes (Basel). 5, 748-766 (2014).
- Saccon, R. A., Bunton-Stasyshyn, R. K., Fisher, E. M., Fratta, P. Is SOD1 loss of function involved in amyotrophic lateral sclerosis?. Brain. 136, 2342-2358 (2013).
- Acevedo-Arozena, A., et al. A comprehensive assessment of the SOD1G93A low-copy transgenic mouse, which models human amyotrophic lateral sclerosis. Dis Model Mech. 4, 686-700 (2011).
- Gurney, M. E., et al. Motor neuron degeneration in mice that express a human Cu,Zn superoxide dismutase mutation. Science. 264, 1772-1775 (1994).
