Cuantificación del crecimiento intracelular dentro de los macrófagos es un rápido y confiable método para evaluar la virulencia de los parásitos de Leishmania
Summary
Todas las especies patógenas de Leishmania residen y replican dentro de macrófagos de hospederos vertebrados. Aquí, presentamos un protocolo para infectar macrófagos derivados de médula ósea murinos en cultura con Leishmania, seguida por la cuantificación precisa de la cinética de crecimiento intracelular. Este método es útil para el estudio de los factores individuales que influyen en la interacción huésped-patógeno y virulencia de Leishmania .
Abstract
El ciclo vital de Leishmania, el agente causal de la leishmaniasis, alterna entre fases de promastigote y amastigote dentro del insecto y anfitriones vertebrados, respectivamente. Mientras que los síntomas patógenos de la leishmaniasis pueden variar ampliamente, desde lesiones cutáneas benignas formas altamente fatal enfermedad visceral dependiendo de la especie infecciosa, todas las especies de Leishmania residen dentro de los macrófagos del huésped durante la etapa de vertebrados de su ciclo de vida. Infectividad de Leishmania por lo tanto está directamente relacionada con su capacidad de invadir, sobrevivir y replicarse dentro de las vacuolas parasitófora (PVs) dentro de los macrófagos. Por lo tanto, evaluar la capacidad del parásito para replicar intracelularmente sirve como un método confiable para determinar la virulencia. Estudiar desarrollo de leishmaniasis utilizando modelos animales es lento, tedioso y a menudo difícil, especialmente con las formas viscerales patógeno importantes. Describimos aquí una metodología para seguir el desarrollo intracelular de Leishmania en los macrófagos derivados de médula ósea (BMMs). Parásito intracelular números se determinan intervalos de 24 h de 72-96 h después de la infección. Este método permite una determinación confiable de los efectos de diferentes factores genéticos en la virulencia de la Leishmania . Como ejemplo, mostramos cómo una canceladura solo alelo del gene del transportador de hierro mitocondrial de Leishmania (LMIT1) perjudica la capacidad de la cepa mutante de Leishmania amazonensis LMIT1/ΔLmit1 para crecer dentro de BMMs, que refleja una drástica reducción en la virulencia, en comparación con el tipo salvaje. Este ensayo también permite un control preciso de las condiciones experimentales, que pueden manipularse individualmente para analizar la influencia de diversos factores (nutrientes, especies reactivas de oxígeno, etcetera) en la interacción huésped-patógeno. Por lo tanto, la ejecución apropiada y cuantificación de los estudios de infección de BMM ofrecen una alternativa no invasiva, rápida, económica, segura y confiable a los estudios modelo animales convencionales.
Introduction
La leishmaniasis se refiere a un amplio espectro de enfermedades humanas causadas por especies de parásito protozoario del género Leishmania. Cerca de 12 millones de personas están actualmente infectadas con Leishmania en todo el mundo, y más de 350 millones están en riesgo. La patología de la enfermedad depende de la especie de Leishmania y en factores del anfitrión, y los síntomas varían desde lesiones de piel de auto-sanación inofensivo a formas letales de visceralizing. Si la leishmaniasis visceral, sin tratamiento es fatal, ranking sólo después de la malaria como la mortal enfermedad humana causada por infección con un parásito protozoario1. A pesar de las amplias diferencias en patología de la enfermedad y los síntomas, todas las especies de Leishmania tienen un ciclo de vida digenic alternando etapas de promastigote y amastigote dentro de insectos huéspedes vertebrados, respectivamente. Dentro de vertebrados, Leishmania macrófagos host para invasión de destino e inducen la formación de vacuolas parasitófora (PVs), compartimientos ácidos con propiedades de phagolysosomes donde replican las formas de amastigote altamente virulenta. Los amastigotes persisten en los tejidos del huésped durante las infecciones crónicas y pueden pasarse hacia adelante para no infectada flebótomos, completando el ciclo de transmisión. Por lo tanto, en el contexto de desarrollo humano de la enfermedad, los amastigotes son la Leishmania más importantes del ciclo de vida forma2. Investigar cómo replicar amastigotes dentro del macrófago PVs es fundamental para comprensión Leishmania virulencia3,4,5,6,7 y para el desarrollo de nuevas terapias eficaces.
Aquí describimos un método que se utiliza regularmente por nuestro laboratorio para el estudio de infección por Leishmania y replicación en macrófagos derivados de médula ósea (BMMs), lo que implica la evaluación cuantitativa del número de intracelular de Leishmania en el tiempo. Este proceso involucra la recolección de los monocitos de la médula ósea de ratón y diferenciación a macrófagos en la cultura, en vitro infección con formas infectantes (promastigotes métodos o amastigotes) de Leishmania y cuantificación de la número de parásitos intracelulares en cada intervalo de 24 h para un periodo de 72-96 h después de la infección. Este análisis se ha utilizado en nuestro laboratorio para determinar el impacto de varios factores ambientales y genes del parásito, incluyendo la identificación de la función crítica de hierro en la promoción de virulencia de L. amazonensis que además fue validado por bandolero estudios de desarrollo de la lesión en ratones6,8,9,10,11,12,13,14,15 . Como todas las especies patógenas de Leishmania establecen su nicho replicativa dentro de macrófagos del huésped, este ensayo puede utilizarse universalmente para determinar la virulencia en todas las especies de Leishmania .
Realizar infecciones BMM permite el análisis de las interacciones huésped-parásito en el nivel de la célula y así una comprensión más amplia de cómo interactúan los parásitos de Leishmania con su microambiente anfitrión favorito, el PVs de los macrófagos. Análisis de la infección de macrófagos se han utilizado con éxito por múltiples grupos16,17,18,19,20,21,22 a explorar funciones de los macrófagos del huésped y genes específicos de Leishmania y su posible participación en la compleja interacción que caracteriza la infección intracelular. Infecciones de BMM permiten la cuantificación del crecimiento del parásito como un indicador del impacto de factores del huésped que influyen en la supervivencia intracelular, como la producción de óxido nítrico de microbicidas, generación de especies reactivas de oxígeno y otras condiciones adversas encontrados dentro del lisosoma-como PVs23. Análisis de la infección de macrófagos también han sido utilizados para identificar potenciales leishmanial anti drogas conduce para desarrollo terapéutico13,24.
La naturaleza en vitro de las infecciones de BMM proporciona varias ventajas sobre otros métodos para evaluar la virulencia de la Leishmania . Sin embargo, varios estudios anteriores examinando mecanismos de supervivencia del parásito intracelular con el tiempo no se cuantificó la infección como una tasa de21,20,24. Además, muchos estudios se centró en seguir en vivo las infecciones con el tiempo lo hicieron midiendo el tamaño de la lesión cutánea y otros síntomas fisiológicos que están sólo indirectamente relacionados con parásito replicación25,26 , 27. infección in vivo es un enfoque riguroso para evaluar la virulencia del parásito, pero mediciones de tamaño de lesión basadas en bandolero solo la hinchazón a menudo son insuficientes, ya que reflejan la respuesta inflamatoria en los tejidos infectados y no la número absoluto de parásitos. Por esta razón, el desarrollo de la lesión de bandolero ensayos tienen que ser seguida por la cuantificación de la carga del parásito en tejidos infectados, un procedimiento que requiere dilución limitante largo ensayos de28. Además, en vivo los estudios implican a menudo sacrificar varios animales en diferentes puntos en el tiempo para extraer los tejidos de interés6,8,9,10, 11 , 13. en cambio, gran número de BMMs puede obtenerse en un animal, y estas células pueden ser bajo condiciones que permiten la evaluación de la infección en varios puntos en el tiempo. Además, en comparación con estudios en vivo , realizar en vitro infecciones BMM permite un mayor control sobre las condiciones experimentales. Cuantificación de los macrófagos infectados con los parásitos permite un control preciso de la multiplicidad de infección (MOI) y de las condiciones de cultivo. Control fino sobre estos factores puede ser clave en la identificación de las características de las vías celulares discretas y en la comprensión de su impacto en el curso de la infección.
Dadas estas ventajas, es algo sorprendente que muy pocos grupos de estudio de virulencia de Leishmania han tomado hasta ahora aprovechando el gravamen cuantitativo de la replicación intracelular en los macrófagos. En este artículo, discutimos los errores comunes que pueden obstaculizar la utilización más amplia de este ensayo y proporcionar un protocolo paso a paso para facilitar su correcta ejecución. Teniendo en cuenta su precisión y versatilidad, el ensayo de infección de BMM que se describe aquí puede no sólo utilizarse para explorar las interacciones huésped-patógeno que influyen en la virulencia de la Leishmania , pero también para el estudio de otros microorganismos que repliegan dentro de los macrófagos29. Lo importante es que, este ensayo se puede desarrollar como un método de cribado clínico previo rápido y económico para el desarrollo de fármacos anti-leishmanial.
Protocol
Representative Results
Discussion
Los datos cuantitativos producidos por el ensayo de infección de BMM descrito anteriormente, permite a los investigadores obtener las tasas de infección y una determinación confiable de cambios en las propiedades de virulencia en un período de tiempo relativamente corto (máximo 2 semanas, en comparación con el 2 meses necesarios para experimentos en vivo ). Este método se basa en el tinte específico DNA DAPI, que específicamente las manchas núcleos macrófago y parásito y permite la rápida identifica…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue financiado por los institutos nacionales de la subvención de salud AI067979 to1 a NWA.
YK es beneficiario de beca de pregrado de la Howard Hughes Medical Instituto/Universidad de Maryland College Park.
Materials
| 6 well cell culture plate | Cellstar | 657160 | |
| Adenine | Acros Organics | AC147440250 | |
| Aerosol Barrier Pipet Tips (100-1000 μL) | Fisherbrand | 02-707-404 | |
| Aerosol Barrier Pipet Tips (20-200 μL) | Fisherbrand | 02-707-430 | |
| Aerosol Barrier Pipet Tips (2-20 μL) | Fisherbrand | 02-707-432 | |
| Bard-Parker Rib-Back Carbon Steel Surgical Blade #10 | Aspen Surgical | 371110 | |
| BD Luer-Lok Tip 10 mL Syringe | Becton Dickinson (BD) | 309604 | |
| BD Precisionglide Needle, 25G | Becton Dickinson (BD) | 305124 | |
| Cell Culture Dish 35 mm x 10 mm | Cellstar | 627 160 | |
| Cell Culture Flask | Cellstar | 660175 | |
| Cover Glasses: 12 mm circles | Fisherbrand | 12-545-80 | |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | Invitrogen | D1306 | |
| D-Biotin | J.T. Baker | C272-00 | |
| EDTA | Sigma Aldrich | EDS | |
| Ethyl alcohol 200 proof | Pharmco-AAPER | 111000200 | |
| Falcon 100 mm x 15 mm non-TC-treated polystyrene Petri dish | Corning | 351029 | |
| Fetal Bovine Serum | Seradigm | 1500-500 | |
| Ficoll400 | Sigma Aldrich | F8016 | |
| Fluorescence Microscope | Nikon | E200 | |
| Goat anti-mouse IgG Texas red | Invitrogen | T-862 | |
| Goat anti-rabbit IgG AlexaFluor488 | Invitrogen | A-11034 | |
| Hemin | Tokyo Chemical Industry Co. LTD | H0008 | |
| HEPES (1M) | Gibco | 15630-080 | |
| Isoton II Diluent | Beckman Coulter | 8546719 | |
| L-Glutamine | Gemini | 400-106 | |
| Medium 199 (10X) | Gibco | 11825-015 | |
| Na pyruvate (100 mM) | Gibco | 11360-070 | |
| Paraformaldehyde | Alfa Aesar | 43368 | |
| Penicillin/Streptomycin | Gemini | 400-109 | |
| Phosphate Buffered Saline (-/-) | ThermoFisher | 14200166 | |
| Polypropyline conical Centrifuge Tubes 15 mL | Cellstar | 188 271 | |
| Polypropyline conical Centrifuge Tubes 50 mL | Cellstar | 227 261 | |
| ProLong Gold antifade reagent | ThermoFisher | P36930 | |
| Rat anti-mouse Lamp-1 antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank | 1D4B | |
| Recombinant Human M-CSF | PeproTech | 300-25 | |
| Reichert Bright-Line Hemocytometer | Hausser Scientific | 1492 | |
| RPMI Medium 1640 (1X) | Gibco | 11875-093 | |
| Triton X-100 Surfactant | Millipore Sigma | TX1568-1 | |
| Trypan Blue | Sigma Aldrich | T8154 | |
| Delicate Scissors, 4 1/2" | VWR | 82027-582 | |
| Dissecting Forceps, Fine Tip | VWR | 82027-386 | |
| Microscope Slides | VWR | 16004-368 | |
| Z1 Coulter Particle Counter, Dual Threshold | Beckman Coulter | 6605699 |
Riferimenti
- WHO. Control of the leishmaniases. World Health Organ Tech Rep Ser. (949), (2010).
- Naderer, T., McConville, M. J. Intracellular growth and pathogenesis of Leishmania parasites. Essays Biochem. 51, 81-95 (2011).
- Rosenzweig, D., et al. Retooling Leishmania metabolism: from sand fly gut to human macrophage. FASEB J. 22 (2), 590-602 (2008).
- Lahav, T., et al. Multiple levels of gene regulation mediate differentiation of the intracellular pathogen Leishmania. The FASEB Journal. 25 (2), 515-525 (2011).
- Saunders, E. C., et al. Induction of a stringent metabolic response in intracellular stages of Leishmania mexicana leads to increased dependence on mitochondrial metabolism. PLoS Pathog. 10 (1), e1003888 (2014).
- Mittra, B., et al. Iron uptake controls the generation of Leishmania infective forms through regulation of ROS levels. J Exp Med. 210 (2), 401-416 (2013).
- Kloehn, J., et al. Using metabolomics to dissect host-parasite interactions. Curr Opin Microbiol. 32, 59-65 (2016).
- Huynh, C., Sacks, D. L., Andrews, N. W. A Leishmania amazonensis ZIP family iron transporter is essential for parasite replication within macrophage phagolysosomes. J Exp Med. 203 (10), 2363-2375 (2006).
- Flannery, A. R., Huynh, C., Mittra, B., Mortara, R. A., Andrews, N. W. LFR1 Ferric Iron Reductase of Leishmania amazonensis Is Essential for the Generation of Infective Parasite Forms. J Biol Chem. 286 (26), 23266-23279 (2011).
- Miguel, D. C., Flannery, A. R., Mittra, B., Andrews, N. W. Heme uptake mediated by LHR1 is essential for Leishmania amazonensis virulence. Infect Immun. 81 (10), 3620-3626 (2013).
- Cortez, M., et al. Leishmania Promotes Its Own Virulence by Inducing Expression of the Host Immune Inhibitory Ligand CD200. Cell Host Microbe. 9 (6), 463-471 (2011).
- Mittra, B., Andrews, N. W. IRONy OF FATE: role of iron-mediated ROS in Leishmania differentiation. Trends Parasitol. 29 (10), 489-496 (2013).
- Mittra, B., et al. A Trypanosomatid Iron Transporter that Regulates Mitochondrial Function Is Required for Leishmania amazonensis Virulence. PLoS Pathog. 12 (1), e1005340 (2016).
- Ben-Othman, R., et al. Leishmania-mediated inhibition of iron export promotes parasite replication in macrophages. PLoS Pathog. 10 (1), e1003901 (2014).
- Renberg, R. L., et al. The Heme Transport Capacity of LHR1 Determines the Extent of Virulence in Leishmania amazonensis. PLoS Negl Trop Dis. 9 (5), e0003804 (2015).
- McConville, M. J. Metabolic Crosstalk between Leishmania and the Macrophage Host. Trends Parasitol. 32 (9), 666-668 (2016).
- Carrera, L., et al. Leishmania promastigotes selectively inhibit interleukin 12 induction in bone marrow-derived macrophages from susceptible and resistant mice. J Exp Med. 183 (2), 515-526 (1996).
- Hsiao, C. H., et al. The effects of macrophage source on the mechanism of phagocytosis and intracellular survival of Leishmania. Microbes Infect. 13 (12-13), 1033-1044 (2011).
- Murray, A. S., Lynn, M. A., McMaster, W. R. The Leishmania mexicana A600 genes are functionally required for amastigote replication. Mol Biochem Parasitol. 172 (2), 80-89 (2010).
- Farias Luz, N., et al. RIPK1 and PGAM5 Control Leishmania Replication through Distinct Mechanisms. J Immunol. 196 (12), 5056-5063 (2016).
- Franco, L. H., et al. Autophagy downstream of endosomal Toll-like receptor signaling in macrophages is a key mechanism for resistance to Leishmania major infection. J Biol Chem. 292 (32), 13087-13096 (2017).
- da Silva, M. F., Zampieri, R. A., Muxel, S. M., Beverley, S. M., Floeter-Winter, L. M. Leishmania amazonensis arginase compartmentalization in the glycosome is important for parasite infectivity. PLoS One. 7 (3), e34022 (2012).
- Carneiro, P. P., et al. The Role of Nitric Oxide and Reactive Oxygen Species in the Killing of Leishmania braziliensis by Monocytes from Patients with Cutaneous Leishmaniasis. PLoS One. 11 (2), e0148084 (2016).
- Siqueira-Neto, J. L., et al. An image-based high-content screening assay for compounds targeting intracellular Leishmania donovani amastigotes in human macrophages. PLoS Negl Trop Dis. 6 (6), e1671 (2012).
- Pastor, J., et al. Combinations of ascaridole, carvacrol, and caryophyllene oxide against Leishmania. Acta Trop. 145, 31-38 (2015).
- Giarola, N. L., et al. Leishmania amazonensis: Increase in ecto-ATPase activity and parasite burden of vinblastine-resistant protozoa. Exp Parasitol. 146, 25-33 (2014).
- Sacks, D. L., Melby, P. C. Animal models for the analysis of immune responses to leishmaniasis. Curr Protoc Immunol. , 12 (2001).
- Tabbara, K. S., et al. Conditions influencing the efficacy of vaccination with live organisms against Leishmania major infection. Infect Immun. 73 (8), 4714-4722 (2005).
- Price, J. V., Vance, R. E. The macrophage paradox. Immunity. 41 (5), 685-693 (2014).
- Huynh, C., Andrews, N. W. Iron acquisition within host cells and the pathogenicity of Leishmania. Cell Microbiol. 10 (2), 293-300 (2008).
- Blackwell, J. M., et al. SLC11A1 (formerly NRAMP1) and disease resistance. Cell Microbiol. 3 (12), 773-784 (2001).
- Pinto-da-Silva, L. H., et al. The 3A1-La monoclonal antibody reveals key features of Leishmania (L) amazonensis metacyclic promastigotes and inhibits procyclics attachment to the sand fly midgut. Int J Parasitol. 35 (7), 757-764 (2005).
- Spath, G. F., Beverley, S. M. A lipophosphoglycan-independent method for isolation of infective Leishmania metacyclic promastigotes by density gradient centrifugation. Exp Parasitol. 99 (2), 97-103 (2001).
- Zilberstein, D., Shapira, M. The role of pH and temperature in the development of Leishmania parasites. Annu Rev Microbiol. 48, 449-470 (1994).
- Bates, P. A. Transmission of Leishmania metacyclic promastigotes by phlebotomine sand flies. Int J Parasitol. 37 (10), 1097-1106 (2007).
- Bates, P. A., Robertson, C. D., Tetley, L., Coombs, G. H. Axenic cultivation and characterization of Leishmania mexicana amastigote-like forms. Parasitology. 105 (Pt 2), 193-202 (1992).
- Frickmann, H., et al. Rapid identification of Leishmania spp. in formalin-fixed, paraffin-embedded tissue samples by fluorescence in situ hybridization. Trop Med Int Health. 17 (9), 1117-1126 (2012).
- Seguin, O., Descoteaux, A. Leishmania, the phagosome, and host responses: The journey of a parasite. Cell Immunol. 309, 1-6 (2016).
- Wanderley, J. L., Thorpe, P. E., Barcinski, M. A., Soong, L. Phosphatidylserine exposure on the surface of Leishmania amazonensis amastigotes modulates in vivo infection and dendritic cell function. Parasite Immunol. 35 (3-4), 109-119 (2013).
- Crauwels, P., et al. Apoptotic-like Leishmania exploit the host’s autophagy machinery to reduce T-cell-mediated parasite elimination. Autophagy. 11 (2), 285-297 (2015).
- Bringmann, G., et al. A novel Leishmania major amastigote assay in 96-well format for rapid drug screening and its use for discovery and evaluation of a new class of leishmanicidal quinolinium salts. Antimicrob Agents Chemother. 57 (7), 3003-3011 (2013).
- Sacks, D. L., Brodin, T. N., Turco, S. J. Developmental modification of the lipophosphoglycan from Leishmania major promastigotes during metacyclogenesis. Mol Biochem Parasitol. 42 (2), 225-233 (1990).
- Sacks, D. L. Leishmania-sand fly interactions controlling species-specific vector competence. Cell Microbiol. 3 (4), 189-196 (2001).
- McConville, M. J., Turco, S. J., Ferguson, M. A., Sacks, D. L. Developmental modification of lipophosphoglycan during the differentiation of Leishmania major promastigotes to an infectious stage. EMBO J. 11 (10), 3593-3600 (1992).
- Sacks, D. L., Hieny, S., Sher, A. Identification of cell surface carbohydrate and antigenic changes between noninfective and infective developmental stages of Leishmania major promastigotes. J Immunol. 135 (1), 564-569 (1985).
- Yao, C., Chen, Y., Sudan, B., Donelson, J. E., Wilson, M. E. Leishmania chagasi: homogenous metacyclic promastigotes isolated by buoyant density are highly virulent in a mouse model. Exp Parasitol. 118 (1), 129-133 (2008).
- Almeida Marques-da-Silva, E., et al. Extracellular nucleotide metabolism in Leishmania: influence of adenosine in the establishment of infection. Microbes Infect. 10 (8), 850-857 (2008).
- Moreira, D., et al. Impact of continuous axenic cultivation in Leishmania infantum virulence. PLoS Negl Trop Dis. 6 (1), e1469 (2012).
- Svensjo, E., et al. Interplay between parasite cysteine proteases and the host kinin system modulates microvascular leakage and macrophage infection by promastigotes of the Leishmania donovani complex. Microbes Infect. 8 (1), 206-220 (2006).
