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Neuroscienze

마 취 유도 Neurotoxicity 그대로 돼지 뇌에서의 연구에 대 한 Microelectrode 배열 기술의 적응

Published: May 12, 2018
doi:
10.3791/57391
, , , , , , , , , ,
1Department of Anesthesiology,Ohio State University College of Medicine, 2Medical Student Research Program,Ohio State University College of Medicine, 3Department of Anesthesiology and Pain Medicine,Nationwide Children’s Hospital, 4Department of Neuroscience,University of Kentucky Medical Center

Summary

이 연구에서는 piglets. 에서 신경 전달 물질 활동 vivo에서 효소 기반 microelectrode 배열 (MEA) 기술의 새로운 사용 가설 그 조미료 dysregulation 마 취 neurotoxicity의 메커니즘에 기여 했다. 여기, 우리 마 취 유도 neurotoxicity의 메커니즘 연구 나 기술에 맞게 프로토콜을 제시.

Abstract

매년 수백만의 어린이 절차의 무리에 대 한 마 취를 받 다. 그러나, 동물 및 인간 연구 라는 질문으로 개발에 두뇌에 잠재적으로 유독한으로 마 취약을 내포 하는 아이 들에 있는 마 취 안전. 날짜 하려면, 아무 연구에 따라 장치를 마더보드에 해명 성공적으로는 마 취에 의해 신경 수 있습니다. 동물 연구 허용 같은 메커니즘의 조사 그리고 신생아 piglets 인간의 두뇌에 그들의 눈에 띄는 발달 유사성으로 인해 이러한 효과 공부 하는 우수한 모델을 나타냅니다.

이 프로토콜에 따라 마 취 유도 neurotoxicity (아 인)의 장치를 마더보드에 공부를 새로운 방법으로 효소 기반 microelectrode 배열 (MEA) 기술을 사용 하 여를 적응 시킨다. MEAs는 vivo에서 신경 전달 물질 활동의 실시간 모니터링을 활성화 하 고 뛰어난 시간적, 공간적 해상도 제공. 그것은 마 취 neurotoxicity는 조미료 dysregulation 일부 발생 및 MEAs 조미료를 측정 하는 방법을 제공 가설입니다. 돼지 모델에서 MEA 기술의 새로운 구현 아 인 연구를 위한 독특한 기회를 제공합니다.

Introduction

매년 수백만의 어린이 미국1에 침략 및 비-침략 적 절차에 대 한 마 취를 받 다. 년, 마 취 공급자 마 취약, 소아 및 신생아에도 안전의 부모 안심 했습니다. 그러나, 1999 년에 그것은 발견 그 과도 초기 생활 동안 글루타민 산 염 수용 체의 N-메 틸-D-aspartate (NMDA) 하위의 막힌 쥐2에 광범위 한 신경 apoptosis를 발생할 수 있습니다. 최근에, FDA 발표 마약 안전 통신 일반 마 취약 그리고 3 세 이하의 어린이의 개발 두뇌에 그들의 잠재적인 부정적인 영향에 대 한 경고를 포함 하도록 마 취 약의 라벨을 필요 합니다 (미국 식품 및 약물 관리, 2017)입니다. 그러나, 가능한 메커니즘 및 잠재적인 신경 보호 조치를 명료 하 게 필요가 아직도 있다.

신경 전달 물질 글루타민 산 염, 감마 아미노 낙 산 (GABA) 등의 정상적인 활동이 정상적인 neurodevelopment 발생 합니다. 아 인에 관련 된 통로의 대부분은 여전히 애매, 신경 전달 물질 시스템은 마 취약으로 생산 무 의식에이 경로 조절 하 알려져 있습니다 이후 참여 가능성이 매우. 특히, 흥분 성의 신경 전달 물질의 조미료의 활동은 dysregulated 때 excitotoxicity를 발생 합니다. 이 신경 전달이 물질은 일반적으로 성체, 신경가 소성, 시 냅 스 및 신경 성장, 그리고 여러 다른 매우 중요 한 뇌 기능에 포함 됩니다. 그러나, 글루타민 산 염 수용 체의 장기간된 활성화 excitotoxicity 및 수술, 산소 부족, 및 감소 된 에너지 가용성3같은 스트레스 조건 하에서 특히 신경 apoptosis를 발생할 수 있습니다. 하는 NMDA 글루타민 산 염의 바인딩 수용 체+ Na와 Cl− 유입 되도록 표시 되었습니다. 이후 도발은 캘리포니아2 + 채널 개방으로 이어질 생각 하 고 세포내 캘리포니아2 + 의 출시 저장4. 이 장애 가능성이 결국 신경 확산 감소, 염증, 증가 하 고 신경 죽음으로 이어질 신진 대사으로 혼란의 이끌어 낸다. 이러한 가설에도 불구 하 고 아의 진정한 따라 장치를 마더보드에 불분명5남아 있습니다. Apoptosis에 있는 그것의 역할 때문에 조미료 dysregulation 이전 문서화 신경 apoptosis, AIN의 기능의 메커니즘에 기여할 수 있는 새로운 통로 나타냅니다.

신경 프로세스의 연구에 hindrances 중 하나입니다 그들의 높은 복잡성, 특히 신경 개발의 설정에서. 생활의 처음 몇 개월은 부상, 신경 개발 physiologic apoptosis (전 정 신경) 등의 중요 한 단계는 대부분 동안에 최대 취약점의 기간, synaptogenesis, gliogenesis, 및 myelination 장소6 . 신경 통신의 복잡 한 자연 및 정상적인 CNS 기능을 방해 하지 않고 이러한 과정의 어려움을 감안할 때, 새로운 기술은 개발 되었습니다는 vivo에서 탐지 및 정량화의 중요 한 요소를 목표로 신경 통신 합니다.

MEA 기술은 효소 연결 된 임상 관련 돼지 모델에서 아 인의 메커니즘 연구를 새로운 방법으로이 연구에 사용 되었다. 이 기술은 조미료 dysregulation를 포함 한 전기 두뇌 과정, 복잡 한 vivo에서 공부에 사용할 수 있습니다. MEAs (2 조미료에 민감한 사이트와 2 센 티 넬 사이트)의 통합된 4 채널 플래티넘 기록 사이트 허용 자체 참조, 검출 정확도에 공헌. 또한, 부여 선택도 되 고 다른 방해 분자를 방지 하 여 감지7제외 레이어 각 전극에 적용 됩니다. 또한,는 MEA의 로우 프로 파일 디자인은 이전 기술에 비해 최소한의 조직 외상에 대 한 수 있습니다. 이 같은 기능 MEAs에 뇌에서 미세한 영역의 연구를 용이 하 게 더 높은 공간적 해상도 수 여. 예를 들어 (가 이랑, CA1, CA2) 해 마의 이산 지역 특히 공부8될 수 있습니다. MEAs의 기능에 구체적인 내용은 앞에서 설명한9되었습니다.

MEA 전기 화학에 비해 microdialysis 막 사이 관심의 솔루션을 통합 하 고 extracellular 액체의 검출을 허용 하는 유사한 구성의 솔루션 변경10. Microdialysis 신경의 주류 이며 오래 신경 전달 물질의 검출에 대 한 사용 되었습니다, 그것은 낮은 시간 분해능, 조미료, 변화와 중요 한 조직 외상11의 지연된 탐지의 단점이 있다.

MEAs 직접 감지할 수 없는 신경 전달 물질 글루타민 산 염, 아 세 틸 콜린, 콜린, 등 H2O2 등 O212,13 electroactive 기자 분자를 생성 하는 적절 한 산화 효소 효소를 사용 하 여 .

MEA 기술은 널리 사용 되었습니다 쥐와 비 인간 영장류에 neurotoxicity 아7,14이외의 pathophysiological 프로세스의 맥락에서의 연구에 대 한. 이러한 pathophysiological 프로세스의 일부, MEA 기술 사용 되었습니다 알 츠 하이 머 병, 간 질, 외상 성 뇌 손상, 및 시 냅 스 통신8,15 에 약리 화합물의 효과의 연구 , 16 , 17. MEAs 쥐와 비 인간 영장류에 이러한 병 리를 연구 하는 이용 되었다, 인간과 돼지 두뇌 발달 높은 유사성 게 MEA 기술의 적응 piglets에서 연구를 위한 매우 적합 한 기술 아 따라 장치를 마더보드에18

Protocol

Piglets (Sus scrofa) 오하이오 주립 대학 (OSU) 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC)에 의해 사전 승인 현지 농장을 통해 수신 됩니다. 프로토콜의 승인에 따라 동물 실험 IACUC 정책에 따라 수행 됩니다. 1. 새끼 돼지와 돼지 처리 체계적이 고 무작위 방식으로 제거 도착 지침19에 따라 어떤 잠재적인 섹스 기반 confounders 남성과 여성의 piglets를 활용 합니다.참고: 최대 두뇌 성장 기 돼지 출생의 3-5 일 이내 이므로, 실험 piglets 3-5 일을 전적으로 수행 됩니다. Piglets 물고기 적어도 24 수 있도록 환경에 새 환경 순응 실험 하기 전에 h에 도착을 확인 합니다.참고: 훈련된 수의 직원은 일상적인 동물 보호를 제공합니다. Piglets는 개별적으로 온도 유지, 지속적으로 모니터링 장에 보관 하 고 영양 완전 한 우유 대용품 광고 libitum 저 혈당을 방지 하기 위해 수신. piglets는 또한 마 취 전에 적어도 3 h 우유 대체 (os 당 없음) 없이 보관 하 고 담요와 장난감 자극의 정상 수준을 보장 하기 위해 제공 됩니다. 만약에 가능 하다 면, 사회 화 수 있도록 동일한 장에 여러 piglets를 유지. 2. 개발 및 돼지 모델에서 아 인 연구 MEAs의 사용자 정의 참고:이 기술은 효소 기반 MEAs 미리 효소로 코팅 하 고 m-phenylenediamine dihydrochloride (mPD)와 전기를 사용 합니다. 전극 40 m m 경직 된 샤프트 설계 및 제조 piglets (그림 1)에서 사용 하기 위해 사용자 지정 했다. 중복을 피하기 위해, MEA 준비 및 교정의 자세한 내용은 앞에서 설명한15 (그림 2)를 참조 하십시오. 3. 마 취와는 돼지에 대 한 사용자 지정 Stereotaxic 장치 사용 적절 한 인공 호흡기와 마 취 워크스테이션을 사용 하 여 모니터링 장치, 동물을 anesthetize와 펄스 프로브가, 비-침략 적 혈압, 심전도, 전체 온도 등 생리 적인 매개 변수를 모니터링 합니다 실험의 전체 이전19를설명합니다. 넣어야 하 고 환기는 piglets sevoflurane 마 취 1 최소 치경 농도 (MAC) (약 2.5-3%)에 3.5 헤 훈련된 연구소 직원 멤버는 이러한 실험에 대 한 현재 없는지에 대 한 관리. 모피는 외과 영역 overlying 피부 준비 전에 전기 면도기를 사용 하 여 제거 됩니다.참고: 농도 마 취 제 사용의 기간 수술 동안 실제 마 취 노출의 시간 길이 시뮬레이션 하는 실험을 수 있습니다. 또한, sevoflurane는 가장 일반적으로 활용 하는 최대 중요성의 안전성을 둘러싼 수사를 만들기 소아과 인구에 있는 일반적인 마 취약. Stereotaxic 프레임에 배치 하기 전에 rocuronium 2.5 mg/kg의 복용량 및 1.5 mg/kg의 주입 로드 시작/프레임에 고정 하는 동안 동물 움직임을 방지 하기 위해 h. 장소는 돼지 돼지 전용 stereotaxic 프레임 마 취의 한 번 충분 한 깊이에 발가락 핀치에 의해 확인 된다. 추가 패딩 (예를 들어, 유동층된 포지 셔 너) 압력 궤 양 방지 하기 위해 강제 공기 온난 패드에는 돼지를 배치 하 여 stereotaxic 프레임 내에서 충분 한 패딩을 제공 합니다. 치아에 놓고 위쪽 mandible 치아 (그림 3) 바.참고: 치아 바 자리에 아주 단단히 두개골을 충분 한 수준 이어야 한다. 수정 하 고 관통 귀 바 귀는 돼지 중간 위치에 있는지 확인 하도록 내 조입니다. 위치는 옆의 뾰족한 팁 외가도 삽입 귀 바 봐서 고 막의 침투와 관련 된 “팝업” 소리를 들을 정도로 단단히 내 보유. 단단히 귀 바 두개골에 부착 하 고 (그림 4패널 A) 실험 기간 동안 두개골의 움직임을 방지 하기 위하여 각 측에 동등한 깊이 삽입.참고: 그것은 vitally는 돼지를 따뜻하게 유지 하는 것이 중요 (~ 37.8-38.6 ° C) normothermia의 유지 보수에 대 한 전체 절차 동안 온도 지속적으로 모니터링 하 고. 이 성취를 통해 담요를 그리고/또한 열 램프 하실 수 있습니다. 불타는 동물의 피부를 피하기 위해 적절 한 거리에서 열 램프를 배치 해야 합니다. 메스와 두개골을 득점 하지 않으려면 주의 사용 하 여 두개골에 따라 4-6 cm 중간 절 개를 만듭니다. 일단 절 개 부드러운 철회와 무딘 해 부를 사용 하 여 두 피를 두개골에서 상승 이루어집니다. 부드럽게 문질러 모든 결합 조직을 제거 하 고 봉합 라인 (그림 4패널 B) 노출 거 즈 패드와 함께 두개골.참고: 그것은 비 생존 실험 동안 무 균 유지 필요가 아니다. 그러나, 무 균 생존 실험 동안 유지 되어야 합니다. 더 필요한 경우, 관심 있는 영역을 노출 craniotomy (그림 5패널 A)에 대 한 원하는 위치를 결정 하는 두 피를 반영 합니다. 수술 드릴을 사용 하 여 약 0.25 cm2 (크거나 작은 실험 목표에 따라 있을 수 있습니다)의 craniotomy 창 만들려고 하지 경질 또는 (그림 5 내부 뇌 손상에 주의 사용 하 여 관심사의 구조를 overlying , 패널 B). 미세 수술가 위를 사용 하 여 (그림 5패널 C) 뇌 조직 overlying 경질을 삭제할. 놓고 전극 가능한 세로 bregma 돼지 stereotax micromanipulator에 headstage의 금속 팔을 보호. 두개골의 표면을 없이 가능한 전극을 낮춥니다. (그림 6패널 A) bregma의 좌표를 기록 합니다. 이전 후부와 중간 측면 결정 뿐만 아니라 관심의 구조의 깊이 bregma에 관련 된 좌표. 종과 나이-적절 한 stereotaxic atlas를 사용 하 여 stereotaxic 좌표를 결정 합니다. 이 경우에, stereotaxic 아틀라스 piglets20를 위해 특별히 개발 된를 사용 하 여. 전극 위치를 변경할 적절 한 앞쪽 후부와 중간 측면 위치는 microelectrode와 기구 표면에 수직인는 확인 된. 동물 (그림 6패널 B)와 접촉을 보장 하는 두 피에서 가짜 기준 전극을 배치 합니다. 천천히 그리고 부드럽게, stereotaxic 팔을 사용 하 여 뇌에 적절 한 깊이를 전극 낮은. 마지막 2 mm에 대 한 추가 드라이브는 전극 유압 마이크로 드라이브를 사용 하 여 (그림 6패널 C) 정확한 위치를.참고: 전극 위치 craniotomy 창을 눕 해야 합니다. 전극 깊이 관심의 뇌 구조에 따라 달라 집니다. 비 생존 실험에서 데이터 수집이 완료 되 면 절 개를 닫을 필요는 없습니다. 4. 세포 외 조미료 Sevoflurane 마 취의 측정 돼지는이 절차의 전체에 걸쳐 지속적인 생리 모니터링 중인 확인 하십시오. Piglets는 절차에 대 한 준비에 inhalationally (통해 얼굴 콘) 취. MEA의 주입 후 3 h (그림 7)에 대 한 정확한 측정을 얻을 수 것입니다 수 있도록 초기 계획에 도달 하는 전극 수 있도록 30 분을 기다립니다. 0.25 %bupivacaine (1 mL/kg)은 수술 후 통증 관리에 대 한 수술의 사이트에서 피하 관리 합니다. 또한, 지속적인 릴리스 buprenorphine 제공 됩니다 피하 q72h 필요에 따라. 5. 관류와 희생 앞에서 설명한21으로 관류와 뇌 조직 수집 절차를 수행 합니다. 생존 비 수술 전신 마 취 아래 실험 직후 동물 안락사는. 고정된 돼지 두뇌의 총 횡단면 고 가벼운 현미경 검사 법을 사용 하 여 관심의 영역에서 적절 한 배치를 보장 하는 MEA 배치 확인 수 있도록 앞에서 설명한22 로 전극의 트랙을 시각화.

Representative Results

이 개념 증명 연구 기술로 효소 기반 세라믹 MEA 돼지 모델에서 아 인 기본 조미료 역학에 대 한 뛰어난 통찰력을 제공할 수 있습니다. 이 연구 추가 보여줍니다 효소 기반 MEA 기술을 성공적으로 신경 전달 물질 활동에 높은 감도 높은 공간과 일시적인 생리 및 마 취 관련 변화를 측정 하는 돼지 모델에서 적응 시킬 수 있다 해상도입니다. 임상 관련 메서드를 사용 하 여 표준, 우리의 실험을 통해 생리 항상성 유지 되었다 그리고 아무 돼지 physiologic 물결의 흔적을 전시. 가져온 데이터는 MEAs의 해결 능력을 정확 하 고 공간적으로 대뇌 피 질의 및 하위 대뇌 피 질의 뇌 구조에서 신경 전달 물질 측정을 나타냅니다. Stereotaxic 기구를 사용 하 여 돼지 크기와 해부학에서 개별 차이에 지속적으로 관심의 영역을 찾아 위해 참조 표면 구조 (bregma)의 명확한 id를 수 있습니다. 봉합의 명확한 시각화 마이크로미터 범위 (그림 4)에서 정확도 MEA의 일관 된 지역 배치를 촉진 한다. 뇌의 피 질 표면에 액세스는 최소한 무시할 수 출혈, 외상 성 모든 비보에 조미료 역학 때문에 의도 하지 않은 시스템 또는 로컬 모욕 (그림 5) 하지는 확인. 사용자 지정, 경직 된 MEA 정렬 다음 됩니다 (그림 6) 돼지의 정면 평면에 수직. 제대로 정렬 삽입 전에 MEA를 특히 바꾸어 지역에 대 한 대상 지역의 정확한 공간 녹화를 방지할 수 있습니다. 3-4 일 오래 된 piglets의 된 조미료 측정 실시간 vivo에서 찍은 (n = 4)에서 2.5-3 %sevoflurane 마 취 (약 1 맥). Amperometry 측정 4 Hz에서 기록 되었고 농도 보정 매개 변수 (그림 8패널 A)에 따라 선형 회귀를 사용 하 여 변환. 각 시간 지점에 대 한 수정 된 조미료 신호를 평균된 센 티 넬 신호를 빼기 전에 신호 두 조미료에 민감한 사이트를 평균 했다. 이러한 연속 측정 (그림 8패널 B) 시간이 지남에 더 나은 전반적인 추세를 시각화 하는 이동 평균을 적용 하 여 부드럽게 했다. 평균 기저 조미료 농도 계산 4.61 ± 0.02 µ M 이었고 마 취 노출의 과정을 통해 상대적으로 안정적인 유지. 일시적인 glutamatergic 활동 이전에 센 티 넬 신호와 상관 하지 신호에 봉우리를 분석 하 여 한 동물에서 확인 된 (R2 < 0.5) 3 (그림 9패널 A)의 신호 대 잡음 비율을 초과 하는 고. 총 116 과도 봉우리의 3.5 h (그림 10패널 A)의 기간 동안 감지 했다. 결과 과도 봉우리의 일반적으로 1 µ M 범위 (그림 10패널 B) 내 관찰 되었다. 각 과도의 기간을 측정 하기 위해서는 각 최대 피크 값이 80%를 부패에 필요한 시간 (t80) (그림 9패널 B) 얻은 했다. 3.5 h 녹음 기간 동안 모든 조미료 과도의 평균 t80 4.68 ± 0.82 s (그림 10패널 C) 이었다. 이러한 데이터는 마 취 돼지 두뇌의 바꾸어 지역에서 연장과 일시적인 신경 전달 물질 활동 모두를 정확 하 게 측정 가능 하다는 것을 보여 줍니다. 그림 1: SG-2 microelectrode 배열 형식의 시각적 비교. SG-2 배열을 두 개의 조미료에 민감한 사이트와 두 조미료를 구분 하지 않는 센 티 넬 사이트 (150 µ m x 20 µ m 사이트 당) 포함 되어 있습니다. (A) 유연한 샤프트 microelectrode 배열의 왼쪽에 표시 됩니다. 딱딱한 샤프트 microelectrode 배열 piglets 및 허가 큰 동물에 깊은 주입에 사용 하기 위해 맞춤 설계 했다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오. 그림 2: microelectrode 배열 준비와 교정 과정의 개요. 총 MEA 준비 및 교정 마지막 약 1 주일. 코팅 효소, 제외 계층 및 교정 analytes 관심의 신경 전달 물질에는. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오. 그림 3: 배치 stereotaxic 장치에 돼지의. 돼지 입 개 치아에 직접 후부 입 바에 배치 됩니다. 관통 귀 바 두개골의 뒤 끝을 확보 하 여 귀 운하에 삽입 됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오. 그림 4: craniotomy stereotaxic 장치에 돼지의 배치. (A)는 돼지의 머리는 MEA의 일관 된 배치를 보장 하는 사용자 지정 stereotaxic 프레임 안에 단단히 확보. 관통 귀 바의 동일한 위치에 표시 됩니다. (B) 두 피 따라 중간 앞쪽 후부 절 개. 두개골의 점수는 코로나와 화살 봉합을 시각화 하 고 최적화 bregma의 시각화를 피할 수 있습니다. 눈금 막대는 절 개의 상대적 크기와 craniotomy 윈도우의 위치를 나타내는 표시 됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오. 그림 5: 해 마에 대 한 액세스 Craniotomy. (A) 두 피 추가 노출 stereotaxic 좌표 따라 MEA 삽입의 대략적인 위치를 반영. 동그라미 지역 가이드는 craniotomy (검은 점)을 표시 됩니다. (B) 해골 craniotomy 창 (0.25 cm2) 플랩 기본 dura mater를 노출 제거. (C) meninges 신중 하 게 노출 조직 외상 없이 표면 대뇌 피 질을 제거. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오. 그림 6: MEA 포지셔닝 및 해 마에 삽입. (A) 배치의 MEA는 bregma에 해 마의 상대 stereotaxic 위치 결정. (B) 해 마 삽입 깊이 결정 하는 뇌 표면에 MEA의 Stereotaxic 배치. 의사 기준 전극 (화살표로 표시) 두 피 아래 안전 하 게 배치. (C)는 MEA vivo에서 실시간으로 얻기 위해 적절 한 깊이에 extracellular 조미료 측정 해 마에 삽입. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오. 그림 7: 30 분 기준 기간 동안 MEA 동작. 초기의 급속 한 증가 micromanipulator를 사용 하 여 해 마에는 MEA의 하강에 해당 합니다. 초기 계획 기간에는 MEA (점선)의 적절 한 깊이 도달 했습니다 일단 시작 됩니다. Extracellular 조미료 측정 30 분 동안 줄어 고 생리 판독으로 해석 해서는 안됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오. 그림 8: sevoflurane 마 취 신생아 돼지의 해 마에서 실시간 extracellular 조미료 측정. (A)는 이동 평균 sevoflurane 마 취 (10 데이터 포인트를 사용 하 여) 한 신생아 돼지의 해 마에서 글루타민 산 염 농도의. 측정은 짧은 30 분 기준 기간 후 3 h 4 Hz에서 촬영 했다. (B) 100 포인트 마다 15 분의 이동 평균을 사용 하 여 더 추세를 시각화 하는 조미료 측정의 스무 딩. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오. 그림 9: sevoflurane 마 취 신생아 돼지의 해 마에서 과도 조미료 활동의 식별. (A) 과도 조미료 봉우리 (빨간색)으로 실시간 조미료 추적에 표시 됩니다. 봉우리 3을 초과 하는 신호 대 잡음 비 및 그들의 신호는 센 티 넬 신호와 상관 하지 때 중요 한 고려 되었다 (R2 < 0.5). (B) 그림 9패널 A에서확인 된 대표적인 과도 피크. 점선 라인 80% 부패 피크에 필요한 총 시간을 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오. 그림 10: 조미료 sevoflurane 마 취 신생아 돼지의 해 마에 과도. (A) A 수 15 분 쓰레기통에 과도 조미료 봉우리입니다. 봉우리 3을 초과 하는 신호 대 잡음 비 및 그들의 신호는 센 티 넬 신호와 상관 하지 때 중요 한 고려 되었다 (R2 < 0.5). (B) 과도 조미료의 진폭의 봉우리 오차 막대는 뜻의 표준 오류를 나타냅니다. (C) 과도 조미료 봉우리의 의미 T80 . 오차 막대는 뜻의 표준 오류를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Discussion

이 연구소의 이전 게시21에 설명 된 대로 실험의 시작에서 돼지의 생리 적 항상성 유지 되어야 합니다. 최소한의 모니터링 펄스 프로브가, 심전도, capnography, 비-침략 적 혈액 압력 및 온도 포함 되어야 합니다. 훈련 된 수 사관 필요는 physiologic 섭 (예:포/고 열, 저 산소 증, 저 혈압, 부정맥)을 적절 하 게 수정 하실 수 있습니다.

유도, 이전 MEA 교정 체 외에서 설정 기능 및 알려진 조건 MEA의 선택도 수행 됩니다. 교정 및 MEAs의 도금이 기술의 효과적인 사용을 위해 중요 합니다. 교정 중 발생할 수 있는 많은 오류 들이 있다. 이러한 문제 뿐만 아니라 잘못 된 interferent 응답에 이르게 부적 절 한 도금 교정 식별할 수 있습니다. MEA 응답에서 발생할 수 있는 오류 보다 자세한 테이블 형식 계정 컴파일 되었습니다, 그리고 함께 주목할 만한 원인 및 제안 된 솔루션을 증명 해야 가능성이 문제 해결 (표 1)에 대 한 유용한 악기. 그것은 하나 MEA 기능과 정확도 기록 저하 됩니다는 교정 및 도금 전에 유리 참조 전극 검사 되어야 한다 공기 방울 또는 흰색 변색의 존재에 대 한 참고 해야 합니다.

증상 원인 시정 조치
신호 없음 전극 연결 되지 제대로 연결할 전극 headstage와 빠른 amperometry 시스템을 headstage.
빠른 amperometry 시스템에 전원이 없습니다 빠른 시스템 뒷면에 전원 스위치를 설정
신호 소음 혈액에 오염 된 전극 지속적으로 뇌 표면 전극 삽입 동안 관개
린스 dH2O에서 즉시 전극
효소 코팅은 느슨한 청소 하 고 칠하는 전극
기준 전극 삽입 하지 않았거나 코팅 코트 및 두 피 아래 멀리 참조 전극 배치
전극은 뇌 표면의 움직임 탐지 일반적으로 표면 구조에서 발생합니다. 가능 하면 깊은 전극 (한 번에 1 m m)를 삽입
동물 운동 동물 inadequately 확보 두개골에 후부 방향에서 더 나은 보안 earbars 동물을 이동 합니다. 필요한 경우 더 나은 신체 정렬 있도록 몸통을 상승 합니다.
동물 inadequately 취 마 취 장비의 무결성을 확인 합니다. 적정 한 효과적인 복용량을 마 취는 근육 rocuronium 복용량 (5 mg/kg)를 관리 하 고
부정확 한 전극 배치 전극은 올바르게 정렬 되지 headstage에 적절 한 연결을 유지 하면서 전극 재조정.
Stereotaxic 좌표는 정확 다른 기준점 또는 평면 정렬의 돼지 아틀라스 참조 되 고 사용 하지 않는 확인 하십시오.
두개골을 채 점 하 여 봉합 자국을 보이지 않게 조심 해야.

표 1: piglets에서 사용 하는 MEA를 문제 해결 지침. 가능한 원인과 수정 작업 최적화 및 문제 해결을 지원 하기 위해.

Stereotaxic 아틀라스는 돼지에 대 한 bregma18등 알려진된 포인트와 관련 하 여 관심 분야의 stereotaxic 좌표를 결정 하는 데 사용 됩니다. 귀 바 제대로 두개골 수준 하 고 완벽 하 게 고정 되도록 보호 한다. 한다 주의 피의 중간 절 개 동안 두개골 봉합 라인의 시각화에 영향을 미칠 수 있습니다이 득점을 피하려고. Craniotomy 창은 MEA를 수용 하기에 충분 해야 합니다.

이 프로토콜 잘 운영 스위트와 탐정/팀 프로토콜의 수술 및 마 취 측면에서 숙련 필요로 하는 기술 과제의 수를 제공 합니다. 돼지 모델입니다, 설치류 모델 보다 더 비싼 모델 또한 금융 제한 선물 그러나, 그것은 달러의 수천을 요할 수 있는 비인간적인 대주교의 사용 보다는 적은 비용이 많이 드는입니다. MEA 기술 사용 하 여 코팅의 절차로 그것의 자신의 도전을 선물 하 고 숙련 된 조사 또는 충분 한 선택 및 신뢰할 수 있는 기능을 보장 하기 위해 보조 필요 수동으로 전극 도금. Microelectrodes 자체는 약, 세라믹, 만들어진 고 따라서 쉽게 손상 된 경우 적절 한 주의 관찰 하지 합니다. Microelectrodes 녹음에서 소음을 만들 수 있습니다, 다른 전기 장치에서 그리고 녹음 사이트를 막다 수 요원 사이트에 혈액에서 방해 될 수 있습니다. 특수 장비에 대 한 필요성 stereotaxic 외과 프레임 사용자 지정 주입 하는 동안 돼지 해골을 고정 하 여야 한 추가 부담을 선물 한다. Stereotaxic 프레임, 조미료 산화 효소, 그리고 스스로 전극 모두 비용이 많이 드는 있습니다. 또한, 지난 10 년간에서 돼지 stereotaxic 아틀라스의 부족 돼지 두뇌에서 깊은 구조의 특정 위치를 결정 하는 특정 전문 지식이 필요로 하는 기술적 한계를 포즈. 자기 공명 영상를 사용 하 여 새로운 stereotaxic 아틀라스의 개발 piglets에서이 기술을 사용할 수를 크게 향상 시킬 것 이다.

돼지는 모두 비슷한 뇌 구조와 개발 보유로 패 러 랠이 종과 인간의 신생아 사이 존재 하는 때문에 크게 인 연구를 위한 임상 관련 모델입니다. 쥐 또는 쥐 더 일반적으로 사용 된 모델, 달리는 돼지 모델의 결과의 translatability 하 신 다 인 간에 게는 큰 CNS 유사성을가지고 있습니다. 돼지 모델 또한 저렴 하 고 비 인간 영장류 모델 보다 덜 복잡 한 처리를 포함 한다. 돼지 모델 과정을 검사 하기 위한 것입니다 어떤 마 취에 의해 수 발달 neurotoxicity를 유도, 신경 손상, 기여를 측정 및 변수 혼동으로 인 한 피해의 문제에 대처. 예를 들어, hypoxia 그것이 두뇌에 글로벌 효과 마 취약으로 인 한 피해에 대 한 오해 될 수 있습니다. 돼지는 결과의 품질을 보장 하기 위해 인간의 의학에서 사용한 것과 같은 수술 및 마 취 조건으로 이용 된다.

세라믹 기반 MEA 기술 사용 하 여 microdialysis의 현대 기술와 관련 된 단점 중 몇 가지를 제거 합니다. Microdialysis 지속적으로 기록할 수 여러 조미료 이벤트, MEA 같은 amperometric 방법에 비해 시간적, 공간적 해상도 제한 최대 10 Hz23에서 미세한 영역. 이 빠른 샘플링 속도 microdialysis24같은 느린 샘플링 방법에 내재 된 신경 전달 물질 확산의 혼란 요소를 제거 합니다. 또한,는 MEA microdialysis 프로브는 뜻깊은 gliosis 삽입 하는 동안 발생할 수 있습니다 및 삽입 사이트22에서 신경 전달 물질 활동을 변경할 수 있습니다 보다 적게 침략 적 방법입니다.

포유류 모델, 측정 기술, 그리고 두뇌의 지역 범위를 이용 하 여 이전 연구 기초 조미료 수준 그이 기술을 사용 하 여 비교 설명 했다. 이 MEA 기술, 돼지 모델에 적응 하는 때 유효한 기록의 비보에 조미료 (표 2)를 제공 합니다 제안 합니다.

저자 (년) 녹음 기술 동물 모델 나이 두뇌 지구 기저 조미료 농도 (µ M)를 의미
Hascup 외. (2008)23 MEA (효소 기반) 설치류 20-24 주 전 두 엽 피 질가 3.3 ± 1.0; 5.0 ± 1.2
Hascup 외. (2010 년)25 MEA (효소 기반) 설치류 3-6 개월 해 마 4.7-10.4
러더 포드 외. (2007)9 MEA (효소 기반) 설치류 3-6 개월 전 두 엽 피 질가 44.9 ± 4.7; 7.3 ± 0.9
Miele 외. (1996)26 Microdialysis (효소 기반) 설치류 – 가 3.6 ± 0.5
27 일 외. (2006) MEA (효소 기반) 설치류 3-6 개월 담당의가 1.6 ± 0.3; 1.4 ± 0.2
퀸 테로 그 외 여러분 (2007 년)28 MEA (효소 기반) 비 인간 영장류 5.3-5.5 년 모터 피 질 premotor 외피 3.8 ± 1.7; 3.7 ± 0.9
스티븐 스 연구진  (2010 년) 29 MEA [스펜서-독일 재무 장관-2 (SG-2)] 비 인간 영장류 11-21 년 Putamen 8.53
고다마 외. (2002)30 Microdialysis (효소 기반) 비 인간 영장류 – 전 두 엽 피 질 1.29-2.21
Galvan 그 외 여러분 (2003 년)31 Microdialysis (효소 기반) 비 인간 영장류 청소년 가 28.74 ± 2.73
동안과 스펜서 (1993)32 Microdialysis (효소 기반) 인간의 18-35 년 해 마 20.3 ± 6.6
Reinstrup 외. (2000 년)33 Microdialysis (효소 기반) 인간의 – 담당 16 ± 16
Cavus 외. (2005)34 Microdialysis (효소 기반) 인간의 15-52 년 피 질 2.6 ± 0.3

표 2입니다. 기저 세포 외 조미료 levelsacross의 비교 다양 한 동물 모델. Microdialysis 또는 microelectrodes를 사용 하 여 건강 한 깨어 있고 마 취 동물에 있는 정상적인 세포 외 조미료 수준을 설정 하는 연구의 선택한 검토.

돼지 모델에서 조미료 농도 vivo에서 모니터링할 MEA 기술 사용 하 여 돼지 신경 결과 후 마 취의 미래 평가 대 한 수 있습니다. 것입니다 생존 실험 계획 된 neurocognitive 복지 인간의 신생아의에 마 취의 장기적인 영향에 대 한 이해를 더. 생존 실험 행동 테스트 및 조미료의 모니터링 하면 마 취 노출 후 변경. 그것은 또한 조건에 마 취를 받아야 하는 어린이 위한 일반적인 그들은 외과 개입의 형태로 생리 적 스트레스를 발생할 수 있습니다. Neurotoxicity에 신경학 상 상해 및 증가 수술의 영향을 해결 하는 미래 연구 더 정확 하 게 아이 들을 위한 일반적인 임상 설정의 모델링에 대 한 수 것입니다. 대체 동물 모델의 사용으로 만성 이식, neurotoxicity와 관련 된 행동 변화를 추적할 수 있도록 통해이 다양 한 모델의 연구, 이기도 합니다. MEA 기술 자체는 다재 다능 한, 그래서 미래 연구 조미료 레벨의 분석에 국한 될 필요가 없습니다 (예를 들어, GABA, 콜린, 리 신, 등 수 있는 분석).

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

저자는 Microelectrode 기술 (CenMeT), 켄터키의 대학 센터는 오하이오 주립 대학 실험실 동물 자원 센터 (ULAR)의 기여를 인정 하 고 싶습니다.

Materials

Advance Liqui-Wean Pig Milk Replacer PBS Animal Health 292-13
Piglet Anesthesia Face-Cone Mask VetEquip 921428
Integra SL Anesthesia Workstation DRE Veterinary 2350 This anesthesia workstation is chosen to best mimic the clinical monitoring experienced by pediatric patients in the operating room. Any anesthesia machine can be used as long as it allows for sufficient physiologic monitoring and intervention.
Sevoflurane Ultane 0074-4456-04
Rocuronium Bromide Injection Hospira 0409-9558-05
Medfusion 4000 IV Infusion  Smiths Medical
Model 1530 Heavy-Duty Research Model Stereotax Kopf custom made
Model 1541 Piglet Adaptor Kopf custom made
Infrared Spot Lamp Amazon B000HHQ94C
Bair Hugger Torso Blanket 3M 540
Bair Hugger 3M 750
Sterile Alcohol Prep Pad Fisherbrand 22-363-750
Carbon Steel Rib-Back Surgical Blade Bard-Parker #10
Scalpel Handel Havel's HAN-G4
Surgical Scissors World Precision Instruments 504615
Mosquito Forceps Sklar Surgical Instruments 17-1225
Gauze Pads Fisherbrand 22-246-069
Adson Tissue Forceps Teleflex 181223
Dremel 111 Engraving Cutter Amazon Dremel 111
Microelectrode Array Center for Microelectrdoe Technology, University of Kentucky S2 4Ch MEA; custom made
Headstage Quanteon 2pA/mV
Wire, silver, PFA, .008" Bare, .0110" coated A-M Systems 786500
Fine Micromanipulator Narishige Scientific Instrument Lab MO-8
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Riferimenti

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Geyer, E. D., Shetty, P. A., Suozzi, C. J., Allen, D. Z., Benavidez, P. P., Liu, J., Hollis, C. N., Gerhardt, G. A., Quintero, J. E., Burmeister, J. J., Whitaker, E. E. Adaptation of Microelectrode Array Technology for the Study of Anesthesia-induced Neurotoxicity in the Intact Piglet Brain. J. Vis. Exp. (135), e57391, doi:10.3791/57391 (2018).
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