Bestimmung der Proteinexpressionsgrad in kultivierten Zellen von Immunocytochemistry auf Paraffin-eingebetteten Zellenblöcken

Das Studienprotokoll wurde von der institutionellen Review Board des National Cancer Center, Korea (NCCNCS-12-630) genehmigt. (1) Probenvorbereitung (30 min) Verwenden Sie für die Kultur der HeLa-Zellen (CCL-2, ATCC) 10 mL komplette DMEM Medium (fetale Rinderserum 10 %, 1 % Stift-Strep) in der Kulturschale 100 mm. Inkubieren Sie konfluierende HeLa-Zellen in DMEM ohne fetalen Rinderserum um Serum ausgehungerten HeLa-Zellen vorzubereiten, 48 Stunden, wie in einer früheren Studie11beschrieben. Um die Zellen zu entfernen, waschen Sie sie mit 2 mL Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS) und fügen Sie 2 mL 0,25 % EDTA Trypsin pro 100 mm Kulturschale hinzu. Dann, 2-3 min. in einem CO2 Inkubator bei 37 ° c inkubieren Der Kulturschale Trypsin deaktivieren 5 mL des kompletten DMEM Medium hinzu, und übertragen Sie die freistehenden Zellen auf eine 15 mL-Tube. Zentrifugieren Sie dann die Zellen bei 300 X g für 10 min, eine Kugel zu bilden. Den überstand zu entfernen, und das Pellet zweimal mit 2 mL kaltem PBS durch Zentrifugation bei 300 X g für 10 min waschen. Nach dem Entfernen des Überstands Zelle Pellet 1 mL 95 % Ethanol hinzu, und mischen Sie die Zelle Pellet mit Ethanol durch Vortexen. Bewahren Sie die festen Zellen auf Eis bis Zellenblock Vorbereitung. (2) Zellenblock Vorbereitung (1 h 30 min) Für die Zubereitung von frozen Plasma Zentrifuge bei 13.000 x g für 10 min. sammeln überstand Plasma Aliquote, EDTA-Plasma von gesunden Spenderblut sammeln und aliquoten 200-400 µL in Microfuge Röhren. Speichern Sie die Aliquote bei-80 ° C bis zur Verwendung. Wenn die frozen Plasma Aliquote bereit sind, rufen sie ab und tauen Sie des Plasmas durch Inkubation bei 37 ° C für 5 min auf. Die festen Zellen bei 700 X g für 10 min zentrifugieren, dann den überstand verwerfen. Mischen Sie die Zelle Pellet mit 2 Tropfen (ca. 200 µL) 2 Tropfen Rinderthromboplastin, Plasma und 2 Tropfen von 0,025 M-Kalzium-Chlorid. Dann mischen sie durch pipettieren. Lassen Sie die Mischung bei Raumtemperatur für 10 min, eine Zelle Gerinnsel bilden, wie in Abbildung 2Agezeigt. Dann, waschen Sie der Zelle Gerinnsel mit PBS zweimal durch Gießen und Entfernen von PBS mit Pipette. Das repräsentative weiße Zelle Gerinnsel wird in Abbildung 2 bdargestellt. Befeuchten Sie ein Stück Filterpapier mit Formalin, und wickeln Sie die Zelle Gerinnsel mit vorbefeuchteten Filterpapier. Legen Sie dann die geronnene Masse mit einer Pincette in einer Kassette Gewebe wie in Abbildung 2dargestellt. Ort der Gewebe-Kassette in ein Glas mit 50 mL gepuffertem Formalin (10 % Formalin in PBS) über Nacht bei 4 ° C für Formalin fixieren. (3) Gewebe Verarbeitung und Paraffin einbetten (über Nacht) Die Gewebe-Kassette mit Formalin fixiert Zelle Gerinnsel zu laden über Nacht in einem Gewebe-Prozessor bereits11beschrieben. Die Gewebe Verarbeitung ist für die Entfernung von Wasser und Konditionierung der fixen Zellen vor dem Paraffin einbetten. Führen Sie für Forschung ohne Gewebe verarbeitet das Gewebe Verarbeitung Verfahren, wie in Tabelle 1dargestellt. Schalten Sie den beheizten einbetten Bahnhof und 60 Minuten später, prüfen Sie, ob darin ist geschmolzenes Paraffin in die Metallform (Abb. 2D). Nehmen Sie das Gerinnsel gebildete Zelle aus der Gewebe-Kassette und legen Sie sie in den geschmolzenen Paraffin in die Metallform. Ort die neuen Gewebe-Kassette ohne Deckel in die Metallform, die die Zelle enthält in der Mitte der geschmolzenen Paraffin gerinnen und Gießen mehr geschmolzenen Paraffin in die Gewebe-Kassette und auf die Metallform. Dann lassen Sie das Paraffin in die kalte Platte für 30-60 Sekunden zu festigen. Trennen Sie die Gewebe-Kassette aus der Metallform. Dann ist die Zelle paraffinblock für Immunocytochemistry bereit. Das eingebettete Zelle Gerinnsel in Paraffin-eingebetteten Zellenblock wird durch den Pfeil in Abbildung 2E. 4. Vorbereitung der Folien für Immunocytochemistry (1 h) Überprüfen Sie den Bereich für die Zelle Blutgerinnsel in der Zelle paraffinblock und geschnitten Sie den Zellenblock in Scheiben mit dicken von 3-4 µm mit einem Mikrotom. Setzen Sie Paraffin Abschnitte auf Silan beschichteten Objektträgern, wie in Abbildung 2Fgezeigt. Legen Sie die Abschnitt Folien in einem 37 ° C Ofen für 30 min. in den Abschnitten zu den Folien haften zu machen. 5. Immunocytochemistry von Zellenblöcken (6 h) Hinweis: Für Immunocytochemical Flecken auf Zelle Blockabschnitte, verschiedene Kits verwendet werden können (siehe Tabelle der Materialien). Diese Kits haben verschiedene Empfindlichkeiten und Besonderheiten je nach deren Änderungen. Inkubieren Sie die Abschnitte in 50 mL von Xylol für 4 min zur de-paraffinize. Inkubieren Sie die Folien in 100 % igem Ethanol für 2 min für Dehydrierung, zwei Mal in 95 % igem Ethanol und in 80 % Ethanol für 2 min. Dann entfernen Sie das Ethanol unter fließendem Wasser für 10 Minuten. Legen Sie für Antigen-Retrieval die Folien in einem Glas mit 40 mL Tris-EDTA Abruf Puffer pH 9.0, und in einen Herd für 30 min kochen. Die Objektträger unter fließendem Wasser waschen, und sie in 95 % igem Ethanol für 10 min bei 4 ° c inkubieren Markieren Sie Zelle-Färbung Bereich auf den Folien mit einem Pap-Stift zur einfachen Identifizierung. Waschen Sie die Folien in Tris gepufferte Kochsalzlösung mit 0,2 % Tween 20 (TBS-T) und inkubieren Sie im Wasserstoffperoxid-Block (siehe Tabelle der Materialien) bei Raumtemperatur 15 Minuten Überbleibsel Peroxidase-Aktivität entfernt werden soll. Dann, waschen Sie die Folien in TBS-T dreimal für jeweils 2 min.. Bereiten Sie verdünnten Antikörperlösung durch Verdünnung Primärantikörper im Protein Block (siehe Tabelle der Materialien). Zum Beispiel verdünnt die CKAP2 Primärantikörper sein kann 1: 100 und die Ki-67 Antikörper 1: 500. Inkubieren Sie dann, die Folien in 100 µL verdünnter Antikörper-Lösung für 1 h. Nach dem Waschen in TBS-T fünf Mal für 2 min inkubieren Sie die Folien in der primären Antikörper-Enhancer im Kit für 15 min bei Raumtemperatur im Dunkeln. Tropfen Sie nach dem Waschen in TBS-T vier Mal für 2 min 2 des HRP-Polymer (eine sekundäre Antikörper beschriftet mit Meerrettich-Peroxidase), und inkubieren Sie die Folien bei Raumtemperatur für 30 min. Fügen Sie nach dem Waschen in TBS-T fünf Mal für 2 min, 100 µL der Diaminobenzidine (DAB)-Lösung (siehe Tabelle der Materialien), und die Folien für 3 min inkubieren. Nach dem Waschen in TBS-T zwei Mal, 100 µL Hämatoxylin-Lösung (die Mischung von 100 µL Hämatoxylin und 600 µL destilliertes Wasser) hinzufügen und die Folien für 1 min inkubieren. Nach dem Waschen entwässern die Folien in TBS-T einmal, in 95 % igem Ethanol für 2 min Inkubation und Eintauchen in 95 % igem Ethanol einmal Eintauchen in 100 % igem Ethanol zwei Mal. Dann inkubieren Sie die Folien in 40 mL Xylol im weckglas für 5 min. Wenn die Folien von Xylol trocken sind, montieren Sie die jeweiligen Deckgläsern. Beobachten Sie die Färbung Muster mit Lichtmikroskopie.