Geração de um grande número de progenitores mieloides e células dendríticas precursores de murino medula óssea usando um celular romance classificação estratégia
Summary
Aqui nós fornecemos um método para identificar e isolar um grande número de GM-CSF dirigido pilhas myeloid usando a classificação de células de alta velocidade. Cinco populações distintas (comuns progenitores mieloides progenitoras granulócitos/macrófagos, monócitos, macrófagos derivados de monócitos e DCs derivados de monócitos) podem ser identificadas com base na expressão Ly6C e CD115.
Abstract
Culturas de derivados de monócitos células dendríticas (moDC) geradas a partir da medula óssea de rato usando colônia Granulócito-macrófago estimulando Factor (GM-CSF) têm sido reconhecidas recentemente para ser mais heterogêneo do que anteriormente apreciado. Essas culturas rotineiramente contêm moDC também derivados de monócitos macrófagos (moMac) e até mesmo alguns menos desenvolvidas células como monócitos. O objetivo do presente protocolo é fornecer um método consistente para identificação e separação dos diversos tipos de célula presentes nestas culturas como desenvolvem, para que suas funções específicas podem ser mais investigadas. A estratégia de classificação apresentada aqui separa células primeiro em quatro populações com base na expressão de Ly6C e CD115, ambos os quais são expressas transitoriamente pelas células desenvolvem-se na cultura de GM-CSF-driven. Essas quatro populações incluem comuns progenitores mieloides ou CMP (Ly6C, CD115), progenitores de granulócitos/macrófagos ou GMP (Ly6C +, CD115-), monócitos (Ly6C +, CD115 +) e macrófagos derivados de monócitos ou moMac (Ly6C-, CD115 +). CD11c também é adicionado para a estratégia de classificação para distinguir duas populações dentro da Ly6C-, CD115-população: CMP (CD11c-) e moDC (CD11c +). Finalmente, duas populações podem distinguir ainda mais dentro da Ly6C-, CD115 + população com base no nível de classe de MHC expressão II. MoMacs express níveis inferiores de MHC-classe II, enquanto um precursor de DC derivados de monócitos (moDP) expressa a maior classe de MHC II. Este método permite o isolamento confiável de várias populações distintas desenvolvente em números suficiente para uma variedade de análises funcionais e do desenvolvimento. Destaca-se uma tal leitura funcional, as diferenciais respostas estes tipos de células a estimulação com Pathogen-Associated padrões moleculares (PAMPs).
Introduction
Cultivo de células de medula murino com a citocina fator de estimular colônia granulócitos-macrófagos (GM-CSF) é amplamente utilizado como um método para gerar células dendríticas derivadas de monócitos (moDC; também conhecido como DC inflamatória) em grande número 1, 2,3,4,5. Estas células têm sido extremamente útil em uma variedade de estudos de células dendríticas (DC) função 6,7,8. Normalmente, estas células de medula murino são cultivadas por 6-8 dias e são então utilizadas para o estudo de células dendríticas função 5. Essas culturas tinham sido consideradas principalmente homogêneas, constituído por uma maioria de moDC diferenciada. Mais recentemente, tornou-se claro que no final deste período de cultura dia 6 – 8, há certamente muitas moDC, bem como um grande subconjunto de macrófagos derivados de monócitos diferenciadas (moMacs) 9,10,11. Nossos próprios estudos estenderam ainda mais estes resultados demonstrando que outros subconjuntos de menos células desenvolvidas, tais como precursores moDC (moDP) e monócitos, permaneçam nas culturas com pouca frequência, mesmo depois de 7 dias 10. Assim, estudos da função de células dendríticas (DC) usando células geradas por este sistema podem refletir as respostas de uma coorte mais ampla de tipos de células que anteriormente apreciado.
Temos aprendido muito com o estudo de GM-CSF-gerado moDC relacionadas com a função destas células em fase final de diferenciação 12,13,14. No entanto, compreendemos significativamente menos sobre o caminho do desenvolvimento destas células, 2,15,16 e de como e quando eles apresentam específicas funções, tais como: capacidade de resposta ao patógeno associado Molecular Padrões (PAMPs), fagocitose, 13, de processamento e apresentação do antígeno e atividade anti-bacteriana. Um protocolo para a isolação de um grande número de progenitores de orientado a Flt3L DC convencionais e precursores tem sido relatado 17. Isolamento dessas populações distintas foi conseguido usando carboxyfluorescein succinimidil éster (CFSE)-manchado de células da medula óssea (para controlar a divisão de células) e cultura em Flt3L por 3 dias. As células foram então depleção de células positivas de linhagem e classificadas em progenitoras e precursor das populações com base na expressão de CD11c 17. Outra abordagem pelo grupo do Leenen para identificar primeiros progenitores de DC na cultura de GM-CSF-driven foi classificar as células com base em CD31 e Ly6C 18. O objetivo inicial era criar um método semelhante para a obtenção de progenitores e precursores de GM-CSF-driven moDC. Devido os tipos de célula específica gerados pelo GM-CSF, adaptamos a abordagem e triagem de estratégia baseada na expressão de moléculas que foram expressas em fases iniciais e posteriores do desenvolvimento. Em última análise, determinámos que Ly6C, CD115 (CSF-1 receptor), e CD11c foram os melhores marcadores para distinguir estas células tipos 10.
Aqui, apresentamos um método para isolamento de células em várias fases distintas de desenvolvimento ao longo da via de diferenciação impulsionada pela GM-CSF: monócito Progenitor mieloide comum (CMP), Granulócito-macrófago Progenitor (GMP), macrófagos derivados de monócitos (MoMac) e monócitos-derivado DC (MoDC). A população de moMac pode ser ainda mais segregada com base no nível de classe de MHC expressão II, revelando um precursor de moDC população (moDP) 10. Nós utilizamos uma célula de alta velocidade de fluorescência-ativado classificação estratégia (FACS) para isolar esses 5 populações com base na expressão de Ly6C, CD115 e CD11c. Em seguida demonstramos o exame dessas células em ensaios funcionais, revelando suas respostas à estimulação PAMP.
Protocol
Representative Results
Discussion
Este protocolo facilita o isolamento de GM-CSF-driven progenitor e precursor tipos de células em número suficiente para vários tipos de análises, incluindo ensaios bioquímicos, ensaios de função celular em vitro, ou instilação em vivo. Este método representa um avanço significativo no campo do desenvolvimento de células dendríticas derivadas de monócitos, permitindo o isolamento confiável e identificação de células no início deste caminho do desenvolvimento, bem como os tipos de célu…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Somos gratos pela assistência técnica da Alison Igreja pássaro em Auburn Universidade escola de medicina veterinária Flow Cytometry instalação de, para financiamento do NIH de EHS R15 R15 AI107773 e para o celular e o programa de Biologia Molecular na Universidade de Auburn para o verão de financiamento da investigação ao PBR.
Materials
| RPMI 1640 | Corning | 15-040-CV | |
| Fetal Calf Serum (FCS) | HyClone | SV30014.04 | to supplement complete medium and FWB |
| GlutaMAX | Gibco | 35050 | to supplement complete medium |
| 2-mercaptoethanol (2-ME) | MP Biomedical | 190242 | to supplement complete medium |
| 75mM Vacuum Filter | Thermo Scientific | 156-4045 | to sterilize complete media |
| ACK Lysis Buffer | Lonza | 10-548E | to lyse red blood cell |
| HEPES buffer | Corning | 21-020-CM | to rescue leukocytes after red blood cell lysis |
| Phosphate Buffered Saline (PBS), Dulbecco's | Lonza | 17-512F | must be endotoxin free; chilled at 4 °C |
| 35µm Cell filter | Falcon | 352235 | to break apart clumps before running through cytometer. |
| GM-CSF | Biosource | PMC2011 | usable concentration of 10ng/mL |
| Tissue cultured treated plate | VWR | 10062-896 | for bone marrow cells after harvest |
| Anti-Ly6C, Clone HK1.4 | Biolegend | 128018 | |
| Anti-CD115, Clone AFS98 | Tonbo Bioscience | 20-1152-U100 | |
| Anti-CD11c, Clone HL3 | BD Biosciences | 557400 | to differeniate CMP and MoDCs |
| MoFlo XPD Flow Cytometer | Beckman Coulter | ML99030 | |
| BD Accuri C6 | BD Biosciences | 660517 | |
| 100% Ethanol | Pharmco-Aaper | 111000200CSPP | |
| 60mm Petri Dish | Corning, Inc | 353002 | |
| 50mL Conical tube | VWR | 21008-242 | |
| C57BL/6 Mice | The Jackson Laboratory | 000664 | Female; 10-20 weeks old |
| Biosafety Hood | Thermo Scientific | 8354-30-0011 | |
| 10mL Syringe | BD Biosciences | 301604 | |
| 23-gauge needle | BD Biosciences | 305145 | |
| Centrifuge 5810 R | eppendorf | 22625501 | |
| FlowJo Software v10 | BD Biosciences | Version 10 | flowjo.com |
Riferimenti
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